MBD3蛋白在食管癌细胞DNA损伤修复中的作用研究

Esophageal Carcinoma is one of the most common Malignant Tumors in China. Recent studies showed that tumor cells can enforce DNA damage repair response for their survival and drug-resistance. Furthermore, the role of chromatin remodeling in DNA damage repair has being a research focus. MBD3, a core unit of NuRD complex, plays an important role in chromatin remodeling. However, the relationship between MBD3 and DNA damage repair has not been yet reported. The results of our previous studies showed that MBD3 was up-regulated in the esophageal tumor tissues ,the increase of DNA damage and apoptosis, the arrest in G2/M period and decrease of cell proliferation was obeserved when MBD3 was knockdown. The purpose of our project is to identify the way that MBD3 involved in DNA damage repair, the relationship between DNA damage repair and chromatin remodeling affected by MBD3 and the effect of MBD3 in in vivo DNA damage repair under the treatment of chemotherapeutic drugs. Our project will provide experiment evidence and new ideas for tumor Epigenetics, DNA damage repair and mechanism of resistance to chemotherapeutic treatment.

食管癌为我国常见恶性肿瘤之一，中晚期患者放化疗效果不佳，这可能与肿瘤细胞通过提高DNA损伤修复能力以维持细胞生存及抵抗化疗药物有关。近来，多项研究发现染色质结构重塑在细胞DNA损伤修复过程中起到关键作用，但其作用机制还未彻底解析。MBD3蛋白为NuRD组成部分，参与染色质结构重塑。我们在前期工作中发现:1) MBD3蛋白在食管癌组织中上调；2) MBD3敲减后，食管癌细胞内外源性DNA损伤增加，细胞停滞在G2/M期，细胞增殖减弱，凋亡增加。据此我们提出假设：MBD3蛋白通过改变染色质构象影响食管癌细胞DNA损伤修复过程。本项目拟通过各种分子生物学方法以明确MBD3蛋白在DNA损伤修复途径中的作用方式，MBD3影响染色质构象与DNA损伤修复的关系以及在化疗药物作用下，MBD3对体内肿瘤细胞修复能力的影响。本课题的完成将为肿瘤表观遗传学、DNA损伤修复及肿瘤耐药机理提供新的思路和实验依据。

食管鳞癌是我国常见恶性肿瘤之一，但其发病机制有待进步研究。前期研究发现MBD3在食管癌组织中表达上调；沉默MBD3后，内源性DNA损伤增加，细胞停滞在G2/M期，细胞凋亡途径激活，提示MBD3可能参与食管癌细胞DNA损伤修复。本研究首先对食管癌细胞进行DNA损伤剂处理后，发现MBD3干扰后，细胞DNA损伤程度加剧，G2/M期细胞明显增多；而过表达MBD3后，DNA损伤剂对食管癌细胞DNA损伤减轻，G2/M期细胞减少。.为进步明确MBD3参与DNA损伤分子机制，我们运用染色质免疫沉淀技术和免疫荧光共聚焦实验发现MBD3蛋白可与ATM及CHD4相互结合；MBD3和CHD4是核小体重塑及去乙酰化酶复合体（NuRD）成分，而ATM是DNA损伤修复上游启动分子，提示MBD3可通过改变染色质构象，增强DNA损伤修复。鉴于同源重组修复（HR）途径在G2/M期修复过程中起到重要作用，我们发现食管癌细胞EC-109经5-氟尿嘧啶处理及MBD3沉默后，HR途径成分在DNA损伤处聚集明显减少。.为进步明确MBD3影响染色质构象及DNA损伤修复对下游靶基因的影响，我们筛选相关转录因子在MBD3沉默及5-氟尿嘧啶处理后，转录表达的变化情况。结果表明MTA1同时受到MBD3及DDR调控。接着，我们利用染色质免疫沉淀技术确定了MBD3、CHD4及ATM结合于MTA1启动子区。同时，当食管癌细胞受到5-氟尿嘧啶处理后，MBD3及CHD4结合MTA1减少，而ATM结合增多，提示MTA1可能在DNA损伤后，染色质打开，DNA损伤修复增强。进一步实验证实了食管癌细胞受到5-氟尿嘧啶处理后，MTA1启动子染色质出现开放状态，组蛋白存在活化状态修饰以及DNA去甲基化加强。.究竟MBD3及DDR共调控下游靶基因MTA1在食管癌有何作用，我们做了进步研究。结果发现MTA1 促进食管癌细胞EMT，促进食管癌细胞转移和侵袭；MTA1可结合E-CAD启动子E1-BOX和E3-BOX序列抑制E-CAD启动子活性，并且此过程依赖snail1，slug和HDAC1的共同作用。.在食管癌组织中，我们发现MBD3、CHD4以及ATM有着密切正相关性，而MTA1与MBD3具有正相关趋势。体内实验也发现沉默MBD3后，裸鼠移植瘤体积减小，生长速度减缓，提示MBD3参与在食管癌DNA损伤修复中起到重要作用。