靶向血凝素跨膜亚基HA2的噻吩类H5N1高致命性禽流感进入抑制剂的合成及作用机制

H5N1 influenza A virus (AIV) is a potential serious threat to human health in the near future. Existing drugs have the resistance and side effects. Therefore, the development of new mechanisms of antiviral drugs are the prevention and control of influenza demand,especially in the inhibition of influenza virus into target cells drug, is becoming the reasearch hotspot in the world. This project is to develop new anti-AIV agents targeting the entry step of influenza virus infection. The infection of influenza virus is initiated by the binding of the viral hemagglutinin (HA) to the traget cell receptor.CL-385319 could inhibit the infection of pseudoviruses carrying hemagglutinins from H5N1 strains and it is effective in inhibiting infection of highly pathogenic H5N1 influenza A virus. However, the activity is not high. Computational simulations and experiments of biology have been carried out by our group to uncover the detailed molecular mechanism that the recognition and binding of CL-385319 to HA proceeds by a process of "induced-fit" whereby the binding pocket is formed during their interaction. This "induced-fit" pocket between CL-385319 and hemagglutinin may be a target for structure-based design of more thiophene derivatives influenza fusion inhibitors with IC50 at nM level,and improve the existing "induced-fit"theroy.

H5N1型高致命性禽流感病毒（AIV）是当前人类健康面临的重大威胁。H5N1型流感病毒对现有药物已经产生了耐药性。因此，开发新作用机制的抗流感药物是流感防治的迫切需求，尤其是抑制流感病毒进入的药物，正成为研究的热点。 本项目拟研究作用于病毒进入阶段的抗AIV药物。AIV感染靶细胞的过程由血凝素（HA）介导。CL-385319 为靶向HA的哌啶类小分子流感病毒进入抑制剂。前期我们通过分子动力学模拟和生物学实验发现CL-385319与血凝素蛋白HA2亚基结合是一个"诱导契合"过程，通过诱导契合两者之间形成了一个"三明治"状的靶点。以此靶点为设计目标，发现噻吩类小分子与血凝素蛋白结合力更强，活性更高。因此，本研究以前期理论为基础通过进一步对噻吩类小分子进行改构，以期获得IC50值达到nM水平的特异性流感病毒进入抑制剂，并进一步完善现有的"诱导契合"理论，为开发新作用机制的抗禽流感药物奠定基础。

项目的背景：本课题组前期通过采用H5N1假病毒高通量筛选模型和分子对接等方法曾发现了小分子化合物能特异性抑制HA2亚基，从而抑制禽流感病毒入胞。化合物CL-385319的苯环通过π-π共价与H5N1流感病毒HA2亚基靶穴中芳香环氨基酸残基结合（PLOS ONE. 2012, 7(8):e41956.）。针对此药物靶穴设计的新化合物1L，其噻吩环增强了其苯环与HA的π-π共价结合力，因而其抗H5N1病毒的活性提高，提示化合物1l与HA的π-π共价结合是其抑制病毒的关键（Eur. J Med. Chem. 2012, 57, 211~216.）。基于HA靶穴能与噻吩类化合物π-π共价结合的机制（），我们设计寡聚噻吩类衍生物，推测其与诱导靶穴产生更强的π-π共价结合，因而有可能获得理想病毒进入抑制剂。. 主要研究内容：1） 基于HA靶穴π-π共价结合的机制，设计寡聚噻吩类衍生物，研究化合物的合成、表征。2）采用H5N1假病毒的筛选模型筛选小分子化合物的抑制活性。3）采用MTT法检测药物的细胞毒性和病毒导致的细胞病变（CPE）。4）针对病毒包膜蛋白的生物活性和滴度检测。5）采用假病毒体系初步判定活性化合物特异性靶向HA。6）研究药物与HA2亚基的相互作用。 7） 研究药物对H1N1流感活病毒抑制活性和机制。. 重要结果、关键数据及其科学意义等做简单概述：基于π-π共价结合靶穴设计的寡聚噻吩类化合物对H5N1亚型流感病毒入胞都具有抑制作用，其抑制活性的IC50分别可达0.029~74 μM；SPR检测表明寡聚噻吩类化合物4sc、3sc与HA蛋白结合，进一步研究发现4sc、3sc可以与HA2亚基结合。寡聚噻吩类化合物4sc在体外和体内模型中均具有强效杀H1N1亚型流感活病毒作用，接种量为5 LD50 PR8病毒通过滴鼻接种于小鼠体内。病毒对照组小鼠在感染后的第6-10天全部死亡，生存时间中位数为8.5天；而20 μM或2 μM 4sc预处理的PR8病毒对小鼠无明显损伤作用，小鼠几乎没有出现感染症状，更没有出现任何小鼠死亡；温度和有机物对其杀病毒作用影响较小，且其细胞毒性很小。因此4sc可作为特殊用途的杀病毒剂开发。