兔瘟病毒对不同阶段家兔细胞的侵染机制及其易感细胞系的研究

Rabbit hemorrhagic disease (RHD), caused by rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV), is a highly contagious and rapidly fatal viral disease of both domestic and wild rabbits. Since RHD was first described in China in 1984, it has been reported in many countries successively throughout the world. In this study, based on our researches about detection and prevention of RHDV, vascular endothelial cells, renal cells, hepatic cells, etc many kinds cells, from embryonic period rabbits, lactation rabbits, young rabbits and adult rabbits, will be dissociated and cultured in vitro by using trypsin digestion and tissue pieces culture method. then inoculate RHDV isolates to these kinds cell above to select the cell kind which may fit for RHDV proliferation and sensitiveness. finally, the selected cells will be transfered with pCI-neo-hTERT constructed using lipofectamine for the development of aim continuous cell line, and then observe the culture characteristics of RHDV on the new cell line established.

兔病毒性出血症（rabbit hemorrhagic disease，RHD)是由兔出血症病毒（RHDV）引起兔的一种急性、高度致死性传染病，又称兔瘟，一直以来严重威胁着世界养兔业的健康发展。本研究将在对RHDV检测研究和预防控制临床实践的基础上，采用酶消化法、组织块贴壁法对胚胎期、乳兔期（1-7d）、仔兔期（15-30d）、青壮年期（2月龄以上）等不同生长阶段家兔的肝细胞、肾细胞、血管内皮细胞等几种主要组织细胞进行分离培养和RHDV感染试验，探索RHDV对细胞的吸附侵入机理，选择RHDV较易感的组织细胞；继而对筛选的RHDV敏感细胞通过端粒酶逆转录酶（TERT）转染等技术进行永生化处理或者建立理想的培养方法，以期为进行RHDV致病分子机制以及防控研究提供可靠的细胞材料（研究模型）和科学方法,解决RHDV分离纯化缺乏理想材料的难题。

兔病毒性出血症是由兔出血症病毒（RHDV）引起兔的一种急性、高度致死性传染病，严重威胁着世界养兔业的健康发展。虽然目前国内由于组织灭活苗的使用该病得到有效的控制，但是制约RHDV基础性研究和应用研究的瓶颈并未突破，仍然缺少可适用RHDV的体外培养和研究的材料。为此，本研究开展了不同生长阶段家兔的主要脏器组织原代细胞的分离培养研究、各组织器官原代细胞与家兔的RHDV感染检测试验、目的原代细胞的端粒酶逆转录酶（TERT）转染永生化研究和永生化细胞的RHDV感染检测试验。主要取得以下结果：.（1）确定了兔源原代细胞培养的优选培养条件为 37℃，5% CO2，培养液中胎牛血清浓度5%以上，Vc终浓度为4-16μg/mL。为后续原代细胞的攻毒侵染试验和永生化研究提供了实验依据和科学材料。.（2）通过引物设计、RHDV靶基因的克隆、反应条件优化、特异性试验、敏感性试验、重复性试验和应用实验建立了RHDV的SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法和TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法，两种方法具有良好的特异性和敏感性，敏感性分别可达到81和28个拷贝的靶基因片段，为后续RHDV感染试验和我国RHDV的临床诊断相关研究提供了快速敏感科学可靠的检测技术工具。.（3）经过RHDV的兔子感染试验、原代细胞感染试验确定了永生化研究的肝脏、肾脏和脾脏原代细胞，重组质粒pCI-neo-hTERT鉴定后通过转染筛选获得1株可以稳定传代62代以上的兔肾脏上皮样细胞（命名为RK17），RK17细胞呈梭形，形态较规整，对小鼠不具有致瘤性，传代后4-7d为细胞对数增长期，8 d细胞进入平台期。.（4）同时经过脾脏原代细胞的培养筛选出1株可以稳定传代66代以上的兔脾脏上皮样细胞（命名为RS17），RS17细胞呈梭形，传代后3d即进入细胞对数增长期，6d细胞进入平台期，且对小鼠不具有致瘤性。RHDV RNA细胞转染的初步试验结果显示RHDV RNA转染后可致RS17明显病变作用，提示RS17可用于RHDV致病机理的体外感染研究。.总之，2个可以稳定传代的兔源细胞系RK17和RS17的建立，为RHDV防控相关研究提供了新的试验材料和科学参考。