产溶剂梭菌CcpA蛋白介导的碳代谢物激活效应的分子机制研究

The pleiotropic regulator CcpA mediates the carbon catabolite repression (CCR) and carbon catabolite activation (CCA), two important regulatory processes, in Gram-positive bacteria. However, the molecular mechanism of the CCA remains unclear. Our previous studies showed that CCA strengthening could significantly improve the performance of Clostridium acetobutylicum strains. Moreover, over 90% of the CcpA targeted genes in CCA have no typical binding sites in their regulatory regions. This indicated that there may exist new regulatory mechanism in CCA. In this study, we will analyze the alternations in transcriptional profile which was caused by CCA strengthening in C. acetobutylicum by using transcriptome, DNA/protein interaction and phenotypical observation, then identify the genes that are directly activated by CcpA, and finally, locate the CcpA-binding sites in these targeted genes. The research results will answer the question about if there exists atypical CcpA-binding motif in CCA. On this basis, we will further perform the genome scanning by using the motif. The resulting targeted genes and the CCA-affecting genes in the transcriptional profile will be compared and integrated, which will finally be confirmed by experiments. We hope to dissect the regulatory network of the CcpA-mediated CCA, which will enable us to explain the physiological phenomenon cause by CCA strengthening. The research will not only identify new CcpA-binding motif and refine the regulatory mechanism of CcpA, but also provide foundation for the following genetic engineering.

革兰氏阳性细菌的全局调控蛋白CcpA可介导碳代谢物抑制（CCR）和碳代谢物激活（CCA）两种重要的调控过程，而后者的机制还不清楚。我们的前期研究发现，丙酮丁醇梭菌CCA效应的强化可显著提升菌株的产溶剂性能，且该效应中90%以上CcpA靶基因的调控区没有典型的识别基序，推测可能存在不同于CCR的新调控机制。本项目拟通过转录组和DNA/蛋白互作分析，结合缺失突变、表型观察等方法，鉴定产溶剂梭菌中被CcpA直接激活的靶基因并精确定位其DNA识别位点，发现新型结合基序。在此基础上，运用新的CcpA结合基序进行全基因组搜索，将所获靶基因集群与转录谱结果进行比对、整合，结合实验验证，最终理清丙酮丁醇梭菌CcpA介导的“碳代谢物激活”调控网络，揭示其调控机制，并解释CCA强化所引起的菌株产溶剂性能提高的现象。本研究将完善现有的碳代谢物调控理论，为梭菌代谢工程有理设计提供依据。

丙酮丁醇梭菌是产溶剂梭菌的模式菌株，也是重要的工业菌株。我们的前期研究发现，多效调控蛋白CcpA在丙酮丁醇梭菌中除了介导“碳代谢物抑制效应”（carbon catabolite repression，CCR）外，还具有很强的“碳代谢物激活效应”（carbon catabolite activation，CCA）。在CcpA强化表达后，菌株的生长、糖利用以及产溶剂性能均得到提升。通过转录组分析，发现了新的受CcpA调控的代谢途径，包括受CcpA激活的生物素合成途径和群体效应途径、受CcpA抑制的支链氨基酸合成途径等。.进一步分析发现，在受CCR和CCA影响的基因中，约有90%不含有保守的CcpA识别基序cre（catabolite-responsive element），这提示了在丙酮丁醇梭菌中可能存在新的非典型的CcpA识别基序。正如所料，我们通过生物信息学和分子生物学技术，在丙酮丁醇梭菌中鉴定得到了一个全新的、结构特殊的CcpA识别基序，命名为crevar：NxTGTAAA-YX-TTTACAMx。该识别基序两侧含有一段保守的6-nt的反向重复序列（TGTAAA/TTTACA），中间含有长度可变的间隔区、外侧具有反向重复序列特征的延伸区。其中，保守的反向重复序列以及中间长度可变的间隔区均可以影响CcpA与crevar位点的结合，进而影响CcpA调控功能的发挥。结合信息学分析以及EMSA验证的方法，我们找到了一系列受CcpA直接调控的新靶基因，并构建了由crevar介导的新的CcpA调控网络。另外还发现，crevar基序广泛分布在产溶剂梭菌、芽孢杆菌以及致病菌等革兰氏阳性菌中，表明该识别基序介导的CcpA调控机制在革兰氏阳性菌中可能普遍存在。.转录组分析显示，丙酮丁醇梭菌中CcpA可显著激活生物素合成相关基因在发酵中后期（产溶剂期）的转录，这表明生物素合成途径是CcpA重要的下游调控靶点。因此，我们在丙酮丁醇梭菌中强化了生物素合成途径，并观察到菌株的生物素合成能力增强，溶剂的产量和产率均得到提高。另外，该表型可以通过对生物素合成途径的表达强度调试而进一步得到提升。更为重要的是，这种强化生物素合成途径的代谢改造策略也可以提升溶剂高产菌株的发酵性能。.本项目发表论文6篇，培养研究生2名，按计划完成了任务。