异源物核受体PXR/CAR配体对肝CYP450药物代谢酶DNA表观遗传修饰机制的研究

本研究拟在前期工作的基础上，以大鼠肝癌模型及临床肿瘤患者为对象，采用染色质免疫沉淀(ChIP)、双荧光素酶报告基因转染(LRGT)等分子生物学新技术，与HPLC或LC-MS等经典的药代动力学技术相结合的方法，考察地塞米松(PXR配体), 苯巴比妥(CAR配体), 5-氮胞苷(DNA甲基转移酶抑制剂)、乙烷硒啉(抗氧化抗肿瘤药), 及氨基胍(iNOS硝基化抑制剂)等，对异源物核受体PXR及CAR激活转录过程的关键环节如受体与靶基因DNA特定元件(启动子/增强子)结合、亚细胞定位、靶基因CYP3A与CYP2B表达、CYP3A及CYP2B酶活性表型的影响，以期寻找抗肿瘤药物调控CYP450表达的更具特异性和选择性的新靶点。研究结果不仅可望为肝癌发生的病因学提出新的解释，亦可望为阐明异源物代谢过程中CYP450源性DNA氧化/硝化及DNA甲基化表观遗传修饰机制提供新思路和实验依据。

本课题以转基因mCAR-HepG2肝癌细胞系模型、临床肝癌患者、中国北方不同民族（藏族、维吾尔族、哈萨克族、蒙古族、回族、汉族等）健康志愿者等为对象，采用实时定量PCR法、流式细胞法（FCM）、激光共聚焦显微镜（LSCM）、染色质免疫沉淀法(ChIP)、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF-MS）、重亚硫酸盐特异性PCR法、Western blot法、限制性片段长度多态性-聚合酶链反应法（RFLP- PCR）等方法，对稳定转染代谢性核受体CAR基因的肝癌细胞株模型CYP2B6/CYP3A4/内质网应激蛋白GRP78等基因表达水平、蛋白表达水平、肿瘤细胞凋亡/细胞周期及细胞内活性氧生成的变化、配体药物刺激条件下CAR在细胞浆/细胞核/内质网的亚细胞定位、CYP2B6、CYP3A4及GRP78基因启动子区胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸 （CpG岛）甲基化水平、CYP2B6、CYP3A4及GRP78全基因组甲基化水平、以及CYP2D6、CYP2C8、CYP3A5等药物代谢基因型与代谢表型进行了检测和分析，考察和比较了环境与遗传因素、表观遗传因素对恶性肿瘤发生的影响和可能的调控环节，探讨了核受体PXR/CAR转录激活- 表观遗传修饰--异源物代谢通路在癌发生及肿瘤耐药过程中的作用机制及药物靶点。结果显示，使肝癌细胞周期阻滞于G1期、促使细胞凋亡的作用与CAR及其靶基因CYP2B6及CYP3A4表达、促使 CYP2B6、CYP3A4、GRP78基因启动子区甲基化及全基因组水平甲基化相关，而GRP78基因表达与ROS生成具有一定相关性。中国人群CYP2D6慢代谢基因型（CYP2D6*1/*10和CYP2D6*10/*10）频率显著高于白种人群，其中维吾尔族及蒙古族CYP2D6*10变异性等位基因频率介于藏族及汉族与白种人群之间。提示CYP2D6*10功能性SNPs在中国四个民族间有差异性。245名健康志愿者的CYP2C8与CYP2C9基因多态性与人群吡格列酮药代动力学两者之间未见显著差异，提示基因多态性可能不是影响中国人群吡格列酮药代动力学差异性的主要原因。