海洋岩藻聚糖硫酸酯的结构分析及其作为选择素配体拮抗剂的免疫调节功能的研究

In this project, structure of fucoidan from seaweed and sea cucumber was analyzed by quick and high sensitive HPLC-MS and MS techniques. The aim is the study of the depolymerization and structure analysis of fucoidan. It contains the study of the optimal process conditions of fucoidan depolymerization by free radical depolymerizaition. Then HILIC-MS and HILIC-MS/MS, combined with NMR, was used to analyze the composition and structure of low molecular weight fucoidan. By all the chemical analysis, MS and NMR analysis of low molecular weight fucoidan, we draw out the sequence motif of fucoidan from different resource, the depolymerization mechanism of fucoidan by enzyme and free oxygen radicals. The study will provide theoretical and scientific base for the quality control and function evaluation of fucoidan from marine resource.

本课题以海带和海参岩藻聚糖硫酸酯为研究对象，采用NMR结合快速、灵敏的质谱和液-质联用技术分析其结构。采用自由基氧化降解法降解不同结构岩藻聚糖硫酸酯，应用NMR结合亲水作用-质谱联用技术快速分析低分子量岩藻聚糖硫酸酯的组成和结构，探讨酶解和自由基氧化降解岩藻聚糖硫酸酯的作用机理，比较不同来源岩藻聚糖硫酸酯的结构区别。本研究为海洋岩藻聚糖硫酸酯功能食品中功能因子的分析提供理论依据。

本研究从海带中提取岩藻聚糖硫酸酯，采用离子交换色谱纯化，自由基氧化降解，比较发现，低硫组分4比高硫组分F5更容易降解。自由基氧化得到的低分子量多糖的硫酸根含量和岩藻糖含量较高。由PAGE凝胶电泳分析发现，超滤后得到的分子量大于6 ku的组分中仍然含有分子量小于6 ku的低分子量糖和寡糖，说明用超滤膜的截流分子量确定硫酸多糖的分子量不准确。液-质联用分析岩藻糖产物表明，在二糖-五糖的寡糖中，我们发现二糖有单硫、二硫和三硫二糖，没有未硫酸化的二糖，说明糖链中没有很长的未硫酸化岩藻糖基；单硫的二糖含量最高，说明二糖中有一个岩藻糖基没有硫酸根；三硫酸化的二糖的存在说明岩藻糖中有双硫取代的岩藻糖单糖。糖链长度增加，高硫酸化的糖含量逐渐下降，单硫取代和无硫取代的单糖为主。六糖中至少有2个硫酸根，七糖中有3个硫酸根，八糖中有3个硫酸根。在自由基氧化降解产物中，发现岩藻糖、半乳糖、木糖、糖醛酸混合的复杂糖链，分子量都比较大，杂糖链中，主要是(Gal)4 (Fuc)2，还含有少量的五碳糖（木糖）、乙酰氨基糖和糖醛酸，这与岩藻聚糖的单糖组成分析一致。液-质联用可以分辨15糖之内的所有不同分子量的糖链，根据分子量确定糖组成和硫酸根数量。但是硫酸根位置和糖的序列不清楚，需要进行二级质谱的分析。.本研究采用酶解水提取的方法可以从墨西哥海参中提取硫酸多糖，然后采用强阴离子交换树脂对粗硫酸多糖进行分离纯化，得到岩藻糖化硫酸软骨素和岩藻聚糖组成。我们采用自由基氧化降解，得到低分子量岩藻聚糖，根据降解条件研究，认为最佳水解缓冲液为PBS缓冲液（pH8.0）。采用液-质联用，对自由基氧化降解得到的寡糖进行分析，得到的主要中二糖有无硫、单硫和二硫产物，其中以单硫的二糖最多，说明岩藻聚糖中岩藻糖残基中主要为单硫单糖，还有无硫酸化的岩藻糖，但是没有双硫取代的岩藻糖。四糖中有二硫、三硫和四硫的产物，说明与二糖相比，增加了两个单硫酸化的岩藻糖。我们也发现了四硫和五硫的六糖，四硫和七硫的七糖，说明高硫酸化的部分比较难水解，有的六糖和七糖只含有一个或者两个无硫的岩藻糖。液-质联用有效的分析低分子量岩藻聚糖中糖链的化学性质。