板蓝根中硫代葡萄糖苷-芥子酶系统物质基础及其抗流感病毒活性和作用机理研究

As a typical heat-clearing and detoxifying TCM, Radix Isatidis is playing an increasingly important role in influenza epidemic control. Though its anti-virus effect is generally accepted, the related material basis remains unclear. Some indicated that epigoitrin was the active ingredient, but the substance they investigated was not enantiomerically pure. Our prophase research proved that epigoitrin and its enantiomer goitrin existed in Radix Isatidis simultaneously and the above enatiomers were both the hydrolysates of glucosinolates. Radix Isatidis has considerable glucosinolates but these compounds haven't been paid enough attention. So it's necessary to carry out systematic and comprehensive research on their material basis and activity. In this project, we will first isolate main glucosinolates and the corresponding enzymatic hydrolysates from Radix Isatidis; then evaluate and compare the anti- influenza virus effect of the isolates (including epigoitrin and goitrin and their precursor epiprogoitrin and progoitrin) in vitro and in vivo; finally reveal the active material basis and investigate relative mechanism. Our study can explore a novel way for extensive development of Radix Isatidis, provide theoretic foundation for improvement of the therapeutic effect, and help promote the status of TCM in public health emergency at home and abroad.

板蓝根作为清热解毒的代表中药，近年来在流感疫情防治中发挥着越来越重要的作用。其抗病毒功效虽已得到公认，但有效物质基础始终未能明确。有研究认为表告依春为活性成分，但目前研究所用"表告依春"均非光学纯品。前期研究表明，表告依春与其对映异构体告依春同时存在于板蓝根中，且两者均由硫代葡萄糖苷经芥子酶水解产生。板蓝根富含硫代葡萄糖苷，但该类成分一直未引起重视，有必要对其物质基础和活性开展系统深入的探究。本项目拟对板蓝根中的主要硫代葡萄糖苷及其酶解产物进行提取分离，并对包括表告依春、告依春及相应前体硫苷表前告依春、前告依春在内的一系列化合物的体内外抗流感病毒活性进行评价和比较，揭示活性物质基础，并进一步探讨其作用机理。研究可为板蓝根的深入开发开拓新的领域，为提高其临床疗效提供理论依据，并有助于提升中药在国内外公共卫生事件中的地位。

板蓝根的抗病毒功效虽已得到公认，但有效物质基础始终未能明确。有研究认为表告依春为活性成分，但目前研究所用“表告依春”均非光学纯品。前期研究表明，表告依春与其对映异构体告依春同时存在于板蓝根中，且两者均由硫代葡萄糖苷经芥子酶水解产生。板蓝根富含硫代葡萄糖苷，但该类成分一直未引起重视，有必要对其物质基础和活性开展系统深入的探究。表告依春和告依春互为对映异构体，以C18柱为固定相的传统反相色谱系统无法将两者分离，采用手性正相色谱（NPLC），实现了DL-告依春的首次拆分，成功获得了光学纯的表告依春和告依春；之后又采用通量更高、速度更快的超临界流体（SFC）技术，开发了新的放量拆分、制备方法；NPLC和SFC不适用于以水为介质的样品分析，故新建了适用性更广的手性反相色谱（RPLC）拆分方法，在常规条件下即可实现板蓝根水煎液及板蓝根制剂的手性分析。表告依春和告依春的前体化合物表前告依春和前告依春是互为対映异构体的硫代葡萄糖苷，极性很大，分子结构仅在手性碳的构型上存在区别，制备、拆分难度较高。经研究后采用热乙醇回流提取——酸性氧化铝离子色谱柱净化——制备型离子对色谱拆分等技术，建立了表前告依春和前告依春的放量拆分、制备方法。详细探讨了提取溶剂、方式、温度，粉碎程度等因素对硫代葡萄糖苷-芥子酶系统的影响，确定了硫苷到产物的最佳转化工艺（即板蓝根药材中DL-告依春的最佳提取工艺）。对分离、拆分的组份的体内抗病毒活性加以评价和比较，结果表明前表前告依春、前告依春、表告依春、告依春均对H1N1流感病毒具有抑制作用，效果均明显优于DL-告依春，对映体之间、硫苷与其媒介产物之间抑制率没有太大差别。进一步采用红细胞吸附（HA）、神经氨酸酶（NA）、重组病毒模型、MECK-CPE等手段对各化合物的抗流感病毒机理加以探讨，结果显示表前告依春、前告依春、表告依春、告依春对H1N1流感病毒感染的细胞具有抗细胞病变作用。课题任务按时完成，预算执行到位，获批专利2项，发表文章16篇（收录待发3篇），其中SCI论文3篇。研究结果为深入探讨板蓝根抗病毒作用机理奠定了化学基础，对改进板蓝根制剂生产工艺，提高原料和制剂的质量控制水平，提高板蓝根制剂的临床疗效提供了新的思路。