用于转基因杂交作物生物安全隐患控制的基因自动删除系统的构建

为了消除公众对转基因作物生物安全性的担忧，在前期工作中，项目组基于位点特异性重组酶系统Cre/loxP和FLP/FRT构建了一个基因删除系统"Gene-deletor", 该系统可准确、高效地删除转基因花粉或种子中所有外源功能基因。为了使"Gene-deletor"系统能应用于杂交作物，设想将其拆分为两个无删除活性的部分，分别导入父本和母本中保存，在杂交后代中获得完整的"Gene-deletor"系统，高效删除所有外源基因。为此，本项目拟将重组蛋白直接拆分为两段，并利用蛋白辅助因子促进蛋白重建后酶活的恢复，阐明不同辅助因子对删除效率的影响；同时采用内含肽介导的蛋白互补（IPC）技术对重组酶进行拆分, 筛选出合适的拆分位点, 最终建立起可用于转基因杂交作物的高效基因删除系统。本项目旨在进一步完善"Gene-deletor"系统，使之满足大田生产的需要，实现用转基因作物生产非转基因产品的目标。

为了消除公众对转基因作物生物安全性的担忧，项目组前期基于位点特异性重组酶系统Cre/loxP和FLP/FRT，已构建了一个基因删除系统"Gene-deletor"。该系统能够在转基因植物特定器官（如花粉或种子）中准确、高效地删除所有外源基因，但不影响转基因在其它组织中的正常表达。为了将"Gene-deletor"系统应用于杂交作物中，本项目首先对重组蛋白Cre和FLP结构进行分析，筛选出最佳拆分位点，体外验证拆分蛋白的酶活，进而在转基因烟草发根中验证了拆分和重建恢复重组酶活性的可行性。将核定位信号序列（NLS）SV40分别与重组酶蛋白融合，在转基因烟草发根中证实，SV40能可显著促进其进入细胞核，提高Cre蛋白删除效率。同时，将 Cre蛋白从核苷酸序列第 866 bp处拆分为N端和C端，分别采用直接拆分和采用 内含肽Intein介导的蛋白拆分技术，在转基因烟草证明，采用Intein介导的蛋白拆分技术拆分重组酶Cre可显著提高蛋白重建后的酶活性。进一步构建了用于转基因杂交作物基因删除的“Gene-deletor"系统，将其分别转化拟南芥，获得单拷贝纯合体的亲本，进行杂交，统计杂交后代中删除效率。结果表明，利用intein介导的蛋白拆分技术，以第866个碱基拆分Cre基因，在转基因杂交后代中外源基因的删除效率可达96.736%。PCR扩增证实转基因杂交后代中外源基因被成功删除，测序分析显示杂交后代中识别位点LoxP间的外源基因片段被完全删除。上述结果表明，本课题证明了基于内含肽Intein介导的蛋白拆分技术可用于重组酶蛋白的拆分，在此基础上，构建了一个可用于转基因杂交作物外源基因删除基因删除系统。截至目前，课题组已经在Journal of Experimental Botany、Scientific Reports、Plant Cell Physiology、PLoS One、Tree Physiology等杂志上发表论文10篇，获得发明专利1项。本项目全面完成了原定研究计划，达到了预期研究目标。