OPG/RANKL/RANK系统调控血管新生改善糖尿病小鼠下肢股动脉缺血损伤及机制研究

Diabetic foot is one of the common and severe complications of diabetes and the leading cause of amputation. Peripheral artery disease of lower extremity is the main risk factor of diabetic foot ulcer amputation. The OPG/RANKL/RANK system is associated with islet cell proliferation and hepatic insulin resistance, and is involved in the pathogenesis of diabetes. OPG/RANKL/RANK system is closely related to ischemic arterial disease and diabetic peripheral artery disease of lower extremity. Our previous study showed that compared with wild-type mice，the OPG knockout mice had slower recovery rate of lower extremity perfusion and more severe ischemic injury with impaired angiogenesis after femoral artery ligation. In this study, exogenous recombinant OPG, OPG overexpression and RANKL inhibitor (Denosumab) were used to explore their effects on angiogenesis and ischemic injury after femoral artery ligation in diabetic mice. Mouse endothelial progenitor cells (EPC) and human umbilical cord vascular endothelial cells (HUVEC) were used to investigate the effects of OPG/RANKL/RANK system on the proliferation, apoptosis, migration and tube formation of these cells in mice. Microwell-Seq single cell was adopted to sequence to explore the signaling pathway. We aim to reveal new pathogenesis of diabetic foot and provide new target for prevention and treatment of diabetic foot.

糖尿病足是糖尿病常见而又严重的并发症之一，下肢周围动脉病变是糖尿病足溃疡截肢的主要风险因素。OPG/RANKL/RANK系统与胰岛细胞增殖及肝脏胰岛素抵抗相关，参与糖尿病发病。OPG/RANKL/RANK系统与缺血性动脉疾病和糖尿病下肢周围动脉病变密切相关。我们前期研究发现，和野生型小鼠相比，OPG基因敲除（OPG-/-）小鼠股动脉结扎后，下肢血流恢复减慢，血管新生受损，下肢缺血损伤更严重。本研究在动物水平，研究外源性重组OPG、OPG过表达和RANKL抑制剂（Denosumab）对糖尿病小鼠股动脉结扎后血管新生和缺血损伤的影响；采用小鼠内皮祖细胞（EPC)和人脐带血管内皮细胞（HUVEC），研究OPG/RANKL/RANK系统对小鼠EPC和HUVEC增殖、凋亡、迁移和管腔形成的影响；采用单细胞测序深入探讨信号通路；揭示糖尿病足发病新机制，为糖尿病足防治提供新的作用靶点。

（1）糖尿病下肢动脉缺血是糖尿病常见的并发症之一。糖尿病患者骨保护素（osteoprotegerin，OPG）表达上升，OPG/RANK/RANKL系统激活，并且参与外周动脉疾病的发生发展。本研究中采用链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病模型，通过结扎下肢股动静脉构建糖尿病下肢缺血模型。我们研究发现，和野生型小鼠相比，OPG-/-小鼠股动静脉结扎导致的下肢损伤更严重；高脂饮食喂养、糖尿病均进一步加重野生型小鼠和OPG-/-小鼠股动静脉结扎导致的下肢缺血性损伤，出现较明显的肢体坏疽。OPG-/-的小鼠尤其OPG-/-的糖尿病小鼠股动静脉结扎肢体坏死部分已截断，但在第21天时已长出新肢，提示OPG-/-的糖尿病小鼠肢体缺血损伤严重但再生能力强。OPG和RANK受体拮抗剂Denosama均能够增加HUVEC迁移能力和成管能力，OPG基因敲降和敲除均显著降低HUVEC迁移能力。发现高糖显著抑制内皮祖细胞成管能力，而OPG-/-内皮祖细胞在高糖条件下不受抑制，有待进一步研究。我们的研究提示，OPG在糖尿病下肢缺血中起一定作用，是糖尿病外周动脉疾病防治的潜在靶点。（2）我们通过高脂饮食构建了肥胖小鼠模型，探究了小鼠增肥过程中的多器官的动态病理变化及其机制，建立了包含13,732个蛋白的小鼠多肽谱图库和肥胖小鼠30个器官的定量蛋白质图谱。基于蛋白质组学分析发现，肝脏、胰腺等7个器官是受肥胖影响最显著的器官，各器官呈现出独特的蛋白表达变化特征。为探索肥胖相关的生物标志物和发现新的干预靶点提供了宝贵的资源。（3）基于全球疾病负担研究（Global Burden of Disease Study 2019）数据发现：近30年，随着我国糖尿病患者人数的增加，糖尿病相关肾脏病导致的疾病负担呈上升趋势；低骨密度及其相关骨折的全球疾病负担大幅增加，女性患病风险高于男性；NASH引起的全球肝硬化和肝癌疾病负担显著增加并与年龄、地区和性别有关。（4）缺氧和铁死亡相关基因标记对肾上腺肿瘤具有优异的预测性能，可作为肾上腺肿瘤治疗靶点的新兴来源。