Apelin/APJ系统调控动脉钙化的模式和机制研究

Arterial calcification is a complicated, actively regulated process of mineralization in vessel wall that is similar to bone formation and remodeling. Osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is the important pathological basic change. Apelin can block Ang II actions in atherosclerosis and abdominal aortic aneurysm formation by increasing NO production and inhibiting Ang II cellular signaling. Our previous study showed that apelin inhibited the osteoblastic differentiation of VSMCs through the APJ/ERK and APJ/PI3-K/AKT signaling pathway. Those indicate that Apelin/APJ system could regulate the formation of arterial calcification. In this study, we explore the efficiency of low expression and over expression of Apelin/APJ on the osteoblastic differentiation of VSMCs, by using Real-time PCR, western blot, a recombinant adenovirus vector, gene transfection, and siRNA interference in two classic artery calcification cell models; And explored the potential mechanism including Cbfα1、AP-1 and MAPK pathway.Secondly, we evaluate the occurrence and development of arterial calcification in Apelin and APJ knockout mice. In addition, using OPG(-/-) mice as the artery calcification animal model,explore the effect and potential mechanisms of the Apelin, APJ over expression and gene knockout on arterial calcification. The aim of this study is to reveal new pathogenetic mechanisms and find new potential target of Apelin/APJ system for prevention of arterial calcification.

动脉钙化是血管壁发生的类骨形成的主动调节过程，血管平滑肌细胞向成骨细胞表型分化是其重要的病理基础。Apelin可以抑制血管紧张素II导致的ApoE(-/-)小鼠动脉粥样硬化和腹主动脉瘤的形成。我们研究发现Apelin通过与其受体APJ结合，抑制血管平滑肌细胞向成骨细胞表型分化,提示Apelin/APJ调控动脉钙化的发生发展。本研究采用经典的动脉钙化细胞模型，通过重组腺病毒载体和RNA干扰方法研究低表达和过表达的Apelin/APJ对VSMCs向成骨细胞分化的影响，并对Cbfα1、AP-1 及MAPK 等分化信号通路进行探讨，阐明其调控的作用机制；探索Apelin(-/-)和APJ(-/-)小鼠动脉钙化的发生发展；采用OPG(-/-)小鼠为动脉钙化动物模型，研究Apelin、APJ过表达以及基因敲除对OPG(-/-)小鼠动脉钙化的影响，揭示动脉钙化新的发病机制，为动脉钙化防治提新的作用靶点。

（1）血管钙化（VC）是血管平滑肌细胞（VSMC）向成骨细胞表型分化的结果，是心血管疾病发病和死亡的主要危险因素。Apelin是孤儿G蛋白偶联受体(APJ)的内源性配体。Apelin对心血管系统的保护作用，但Apelin对VC的影响及机制尚未阐明。以碱性磷酸酶（ALP）和骨钙素作为钙化型血管平滑肌细胞（CVSMCs）向成骨细胞分化的标记物。通过细胞外信号调节激酶（ERK）抑制剂PD98059，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K抑制剂LY294002）和APJ siRNA研究信号通路。结果表明：Apelin抑制CVSMCs的ALP活性，骨钙素分泌和矿化结节的形成。采用SiRNA干扰抑制APJ表达，可以抑制Apelin激活CVSMCs的ERK和Akt活性。此外，抑制APJ的表达，抑制ERK和PI3-K的活性，可以消除Apelin对ALP活性的抑制作用。采用CRISPR/Cas9靶向敲除APLN基因，获得APLN基因敲除（Apelin-/-）小鼠。采用维生素D肌肉注射建立VC模型，发现Apelin-/-小鼠主动脉钙化明显严重于野生型小鼠。研究结果表明Apelin通过APJ / ERK和APJ / PI3-K/Akt信号通路，抑制成骨细胞分化的CVSMCs，Apelin基因敲除加重小鼠主动脉动脉钙化，Apelin基因过表达是否逆转动脉钙化还在进一步研究中。我们的研究提示Apelin/APJ系统在动脉钙化中起重要作用，是动脉钙化防治的潜在新靶点。（2）VC是动脉粥样硬化疾病严重程度的标志物。但到目前为止，还没有明确治疗策略来防治VC。我们采用给OPG -/-的小鼠每天皮下注射肽激动剂（GHRH-A）（MR409）连续4周，接受干预的小鼠主动脉钙化明显减轻。在人和小鼠动脉来源的平滑肌细胞（SMCs）中研究机制，表明GHRH-A控制SMCs骨生成是通过PKA和NF-κB（P65）交互作用，抑制ROS产生和Runx2基因和碱性磷酸酶表达，从而阻断炎症介导的成骨作用。GHRH-A具有防治动脉钙化的潜在应用价值。（3）下肢动脉缺血以动脉硬化性闭塞症、血栓闭塞性脉管炎最常见，是截肢的主要危险因素。我们探索性开展OPG/RANK/RANKL系统在下肢缺血中的研究。采用肢股动脉结扎为缺血模型，和野生型小鼠相比，OPG-/-小鼠毛细血管和小动脉密度低，下肢血流恢复慢，灌注情况差，下肢缺血损伤更严重