种植体表面粗糙度调控牙龈成纤维细胞创面愈合表型的分子机制

Successful integration of the implant into the gingival connective tissue plays an extremely crucial role on the longtime survival of the implant. Base on our preliminary investigation implant surface roughness may regulate the gingival fibroblasts earlier extracellular matrix (ECM) remodeling. However, little is known on the molecular mechanism of this issue. So, the aims of this research are to assess ..(1) The influence of 8 typical grades of roughness topographies on organization of HGFs fibrillar adhesions through Immunofluorescence, Fluorescent Time-lapse video microscopy assay..(2)To assess the influence of different grades of roughness topographies on early (<72hrs) HGFs -directed re-modeling of the extracellular matrix (ECM) by means of Immunocytochemistry, Fluorescent Time-lapse video microscopy and SEM..(3) Using varying modern molecular technique to assess the influence of blocking Src/FAK signalling in gingival fibroblasts on different grades of roughness topographies fibronectin deposition and CCN2 expression, as well as a-smooth muscle actin (a-SMA) expression and increased extracellular matrix deposition which is a hallmark of fibrosis..(4)To assess time- and MAPK/ERK 1/2- dependent mature (>72hrs) ECM synthesis and organization by HGFs cultured on 8 grades of roughness topographies by means of Immunocytochemistry, RT-qPCR and Western blotting..(5)To quantify ERK 1/2-mediated gene expression patterns in HGFs cultured on polished and different roughness topographies using DNA microarray , RT2 profiler TM PCR array and Western blotting..Hopefully, this protocol will be useful on the better understanding of the wound healing phenotype at the gingival soft tissue /implant transmucosal sealing region and beneficial of clinical implant.

成功的种植体与牙龈软组织整合是种植义齿长期存留的至关重要的因素。我们前期工作表明种植体粗糙度可能调控牙龈成纤维细胞外基质早期重塑，但其分子机制不明。本研究使用免疫荧光，时间推移视频荧光显微镜、场发射扫面电镜、RT2 profilerTM PCR基因表达谱和Western blotting蛋白印迹等技术研究8种有典型代表意义的不同粗糙度种植材料试样其表面形貌对牙龈成纤维细胞细胞外基质（ECM）纤维粘着的影响；评估不同粗糙度表面形貌对牙龈成纤维细胞细胞外基质重塑的机制；不同粗糙度对(抑制)Src/FAK信号通路的影响，纤连蛋白、结缔组织生长因子和α平滑肌肌动蛋白（a-SMA）的表达及瘢痕化作用机制；不同粗糙度对MAPK/ERK信号通路依赖的牙龈成纤维细胞成熟细胞外基质的合成与组织；用基因芯片技术定量分析ERK 1/2调控的基因表达。本研究有利于揭示种植体穿粘膜区创面愈合的分子机制并造福临床

成功的种植体与牙龈软组织整合对种植义齿长期存留至关重要。但其分子机制不明。本研究的目的是从分子水平探讨基底粗糙度对牙龈成纤维细胞与钛结合及细胞外基质产生的影响。我们采用大颗粒氧化铝喷砂、酸蚀（SLA）的方法，通过3D轮廓测试仪、接触角测定仪、SEM、EDX分析表面形貌；自行培育多株人牙龈成纤维细胞，采用免疫荧ICC、CyQuant Assay及CCK-8、场发射扫面电镜、高通量基因测序RNA sequence，RT-qPCR基因表达和Western blotting蛋白印迹等技术分析研究不同粗糙度表面形貌对牙龈成纤维细胞粘附、增殖、分化，对MAPK/ERK信号通路依赖的牙龈成纤维细胞外基质（ECM）早期重塑、合成与组织的机制；对Src/FAK信号通路的影响，纤连蛋白Fn、和α平滑肌肌动蛋白（a-SMA）的表达及瘢痕化作用；揭示种植体穿粘膜区创面愈合的分子机制。结果表明：成功研制了多种典型的表面粗糙度梯度增加的SLA钛表面：Ra 0.1，Ra 0.5，Ra 1.5, Ra 3.0，Ra 4.0（P < 0.001），表面化学特性为Ti氧化物；且随着粗糙度的增加，微米级凹陷加大，表面接触角增大，亲水性下降（P < 0.05）；在SLA钛表面细胞黏附良好，光滑组优于SLA组（P < 0.05）；随着表面粗糙度的增加，HGF的增殖降低（P < 0.05），但HGF在钛表面的生长形成了垂直或角连接；各组随时间增加，细胞增殖显著增加（P < 0.05）；随着表面粗糙度的增加，纤维粘连蛋白的时空表达与种植材料形貌一致，粗糙度越大，纤维粘连蛋白越少；a-SMA和纤维粘连蛋白表达水平，以梯度衰减；加入Src/FAK信号通路抑制剂PPT2 ，抑制了肌纤维分化的瘢痕化表型；在对多种形貌上的HGFs两万多个基因和5个管家基因测序结果表明：种植体表面粗糙度的增加，表面形貌下调纤维粘连白和a-SMA的表达。结论及临床提示：种植体表面粗糙度可以调控牙龈成纤维细胞外基质重塑及细胞粘附、增殖、分化和细胞外基质组装；中高粗糙度是较好的形貌；研究发现支持本研究设计：使用非创性的手段即选用具有适合的表面形貌的种植体材料可望来改善其与牙龈组织的相互作用和减少种植体表面的纤维化分子表型，延长牙种植体的整体寿命。