结直肠癌三维培养模型中p75NGFR高甲基化活化MKK4促进细胞侵袭转移的机制研究

复发和转移是结直肠患者死亡主因。我们前期发现p75NGFR高甲基化与结直肠癌淋巴结及远处转移密切相关，MKK4高表达可增强肿瘤细胞的侵袭转移；进一步发现p75NGFR高甲基化病例MKK4呈高表达。由此首次提出"p75NGFR高甲基化通过活化MKK4、级联下游MAPK信号通路促进肠癌细胞侵袭转移"新机制。本课题拟进一步通过临床病例检测、沉寂p75NGFR低甲基化及转染p75NGFR高甲基化肠癌细胞株、在三维细胞培养模型中采用激光共聚焦等技术获得p75NGFR活化MKK4可靠证据；通过动物活体成像实验动态观察p75NGFR表达水平对肿瘤生长及侵袭转移影响，从"细胞-动物-病人"多个层次揭示p75NGFR和MKK4在肠癌侵袭转移过程中作用；并筛选参与侵袭转移的下游MAPK通路靶基因，通过系列体外及体内功能实验揭示其调控机制。本课题将为基于p75NGFR/MKK4通路的靶向抗转移治疗提供理论依据。

低亲和力神经生长因子受体（P75 NGFR）是一个潜在的肿瘤抑制基因，其在结直肠癌（CRC）发生发展中的作用是目前知之甚少的。为探究P75 NGFR在CRC中的甲基化状态并进一步了解其生物学功能及临床意义，我们通过硫酸氢钠基因组测序（BGS），定量RT-PCR和Western blot检测在结直肠癌细胞株和组织中P75 NGFR的甲基化状态和表达。我们发现p75 NGFR在CRC细胞中常常成高甲基化状态，并可导致其沉默或下调，而经去甲基化药物处理后P75 NGFR的沉默可以得到恢复。 进而我们通过体外实验构建过表达质粒对P75 NGFR过表达对肿瘤的影响进行了研究，研究结果表明在低表达P75 NGFR的CRC细胞株（HT29和DLD1）中，过表达可以抑制细胞增殖（P <0.01），浸润（P<0.01），抑制细胞集落形成（p<0.01），并诱导细胞凋亡和G1期阻滞。另一方面，沉默高表达P75 NGFR细胞株SW480细胞，可促进细胞增殖（P <0.05），增强侵袭能力（P<0.01）。 P75 NGFR的甲基化可以在大多数65.6％（84/128）的CRC组织中发现，并且多因素分析显示其甲基化与组织学分级，术前血清CA19-9水平密切相关。而P75 NGFR阴性的结直肠癌患者的总体生存期（OS）和无病生存率（DFS）相比于P75 NGFR阳性患者明显降低（64％vs.75％，P = 0.028 OS和61％ vs.72％，P =0.034 DFS）。总之，P75 NGFR在CRC中是一个潜在的抑癌基因，并可以作为一个独立的CRC预后指标。