骨髓神经嵴源细胞对受损周围神经修复作用的研究

Schwann cells play an important role in the development and regeneration of peripheral nervous system, but the source of Schwann cells is significantly insufficient in neurodegenerative diseases and nerve injury. Schwann cells originate from transitory neural crest structure. However, post-migratory neural crest-derived cells (NCCs) exist in various neural crest-derived tissues in fetal even adult stage, so NCCs are potential source of Schwann cells. Bone marrow is one of the neural crest-derived tissues. Although the ratio of NCCs in bone marrow is quite low, bone marrow is a readily accessible tissue source. In this study, we aimed to isolate the epidermal growth factor/fibroblast growth factor-2 (EGF/FGF2) responsive bone marrow stromal cells (BMSCs) subpopulation，not applying genetic labeling technique. Furthermore, Mesenspheres named as postmigratory NCCs derived from bone marrow may be enriched from the bone marrow stromal cells (BMSCs) subpopulation, and Schwann-like cells may be obtained by induced directed differentiation. This protocol would be adapted to obtain human bone marrow NCCs. Additionally, co-culture system in vitro will be used to observe NCCs and derived Schwann cells about their supporting effect on neurons and the myelinating potential ability. Moreover, the peripheral nerve injury animal model will be prepared in rats and rats will be repaired by cell transplantation with NCCs or derived Schwann cells, which is helpful for researchers to reveal the mechanisms of promoting neural regeneration. This study will provide scientific evidence for cell transplantation replacing theraphy to repair injured peripheral nerves.

施旺氏细胞在外周神经发育与再生中起重要作用，可作为细胞移植的种子细胞治疗严重的周围神经损伤和变性疾病。已有的干细胞源施万氏细胞存在诸多缺点：分化纯度低，不能大量增殖，体内存活低，生物功能受限等。施万氏祖细胞可以克服这些问题。我们从施万氏细胞的起源神经嵴源细胞（NCCs）寻找新的细胞来源，已从出生后神经嵴源组织（骨髓)分离培养出间充质球，鉴定为迁移后NCCs，给提供潜在的充足的施万氏祖细胞来源带来希望。本研究项目拟在已有的工作基础上，进一步分离培养骨髓NCCs单细胞亚克隆，通过定向诱导分化以筛选出具有高效施万氏细胞分化潜能的克隆亚群，即施万氏祖细胞亚群，获取大量施万氏细胞。在体外共培养体系中观察NCCs单细胞克隆亚群衍生的施万氏细胞对背根节神经元的营养支持等作用及成髓鞘潜能。在坐骨神经缺损动物模型中，观察并比较移植的NCC亚克隆细胞与衍生的施万氏细胞的促神经修复作用，为临床治疗提供科学依据。

在前期研究中本课题组从大鼠骨髓（bone marrow, BM）成功富集到迁移后神经嵴细胞（neural crest cells, NCCs），并证实这些骨髓神经嵴细胞(BM-NCCs)具有向神经元和各种胶质细胞分化的潜能。发育起源于NCCs的施旺氏细胞（Schwann cells, SCs），是周围神经成髓鞘组织特有的胶质细胞。本研究旨在探索一种可从BM-NCCs直接衍生出大量SCs的方法，以提供应用于神经修复与再生的细胞来源。我们从BM-NCCs分离出多个克隆细胞亚群，这些克隆表现出长期的增殖能力并保持着NCCs的身份，并可被诱导分化为SCs。尤其克隆N1可产生大量高纯度的SCs。N1衍生的SCs与原代背根神经节（dorsal root ganglia, DRG）神经元共培养后还显示了成髓鞘能力。检测结果表明，在蛋白水平和mRNA水平，NCC标志在N1衍生的SCs表达下调，而与SCs分化状态有关的SCs标志则上调。我们进一步用N1细胞的培养液上清（条件培养基）处理氧糖剥夺培养损伤后的DRG神经元，神经元的存活和轴突的生长均得到改善；另外，我们将N1细胞和N1衍生的SCs分别注射入挤压损伤后的大鼠坐骨神经，结果显示N1比衍生的SCs具有更好的促神经再生和功能修复作用；进一步体内实验中，我们将这些N1细胞注射入壳聚糖/丝素支架导管构建组织工程神经移植物，以桥接大鼠坐骨神经10mm缺损，在术后12周中进行了后肢运动和感觉行为学分析、电生理检测、荧光金逆行示踪实验、肌肉和神经的组织学检测，结果显示N1加强了缺损神经再生和髓鞘的形成。本研究表明N1可被认定为施旺氏祖细胞（Schwann cell precursors, SCPs）身份，可用于获得大量SCs，在体内外均可促进受损周围神经元的修复，并可加强缺损神经的再生，有望将来从大动物乃至人类骨髓获取SCPs，应用于细胞为基础的促周围神经修复与再生治疗。