Ngb蛋白转导对脑缺血的保护作用及机制研究

脑梗死急性期治疗手段相当有限，神经保护再次成为研究热点。脑红蛋白Ngb是神经组织的携氧球蛋白，有望成为新型脑保护剂，研究其作用机制十分必要。外源性Ngb蛋白自身无法透过血脑屏障进入脑内，成为制约其临床应用研究的瓶颈。有研究表明TAT蛋白质转导域可高效快速安全地转导大分子蛋白质透过血脑屏障进入脑内发挥作用。本项目借助"RKKRRQRRR"TAT片段转导Ngb透过血脑屏障，在体研究Ngb蛋白转导治疗脑缺血损伤的可行性、有效性与安全性；同时立足前期研究发现的Ngb保护性位点，分别表达针对该位点不同等位基因的TAT-Ngb融合蛋白，比较蛋白功能差异，研究该位点脑梗死保护作用的可能机制；分别构建保护性位点不同等位基因的真核表达质粒，进行瞬时转染及稳定转染，研究选择性剪接在Ngb保护性位点的基因表达调控中的作用，进一步阐明Ngb神经保护作用机制，为脑梗死治疗研究提供新线索和新靶点。

脑红蛋白(Ngb)是具有缺血缺氧保护作用的中枢神经系统的携氧球蛋白。内源性Ngb上调不足以发挥保护作用，外源性Ngb如何安全高效通透细胞膜和血脑屏障成为Ngb神经保护研究亟需解决的科学问题。本项目围绕这一问题开展研究工作，探讨TAT蛋白转导域介导Ngb转运发挥神经保护作用的有效性、可行型及其作用机制。课题组建立并完善了融合蛋白原核表达体系，利用基因重组技术成功制备了含TAT蛋白质转导域的TAT-Ngb融合蛋白。通过免疫印迹和免疫荧光染色等方面证实静脉注射TAT-Ngb融合蛋白，可有效将外源性Ngb蛋白转导透过血脑屏障进入脑组织，主要分布于神经元细胞。课题组在建立标准化的C57BL/6J小鼠MCAO大脑中动脉闭塞模型的基础上，研究发现包含TAT的外源性Ngb融合蛋白在小鼠实验性脑缺血中具有保护作用，抑制细胞凋亡很可能是Ngb神经保护的重要作用机制之一。初步机制研究表明，TAT-Ngb干预可上调抗凋亡因子Bcl-2、调节其调控蛋白，降低Bax/Bcl-2 比值，进而下调下游Caspase-3效应因子活化，有效缓解细胞“糖氧剥夺”(OGD)损伤后线粒体膜电位的下降，从而抑制细胞凋亡，增加细胞生存率发挥神经保护作用。Jak2/Stat3信号通路很可能在TAT -Ngb抗凋亡神经保护作用中发挥了重要作用。课题组经过三年时间，按照原订研究目标开展工作，完成研究任务，证实TAT能转导Ngb穿透小鼠血脑屏障进入脑内神经元，并在脑缺血再灌注损伤中发挥抗凋亡神经保护作用。本研究为新型脑保护剂的研发提供新思路与实验支持，具有临床应用前景与开发价值。目前，课题组仍在本项目研究结果的基础上进行后续的延伸性研究工作。