胃癌小鼠模型中 PD-1 敲除对胃癌炎症微环境及胃癌发生发展影响研究

Blockade of immune inhibitory pathway PD-1/PD-Ls is emerging as an important therapeutic modality for the treatment of cancer. Recent clinical trials have shown that anti-PD-1 agents have profound effects on melanoma and NSCLC regression. However, there are still many problems need to research and solve. And so far there is no any report about blocking PD-1 in gastric cancer patient or mouse model. In our previous study using PD-1 knocking out mice in which stomach tumor formed we found that tumor size was almost same between PD-1 wild type and PD-1 deficiency gastric cancer mouse models although tumor infiltrated CD8+T cells was significantly increased. At the same time we found tumor associated macrophages was increased. In the future, first of all we will try to find out the effect of PD-1deficency on tumor inflammatory microenvironment. The ration and function of immune associated cells infiltrated in tumor will be determined by histology and FACS assay. Second of all, we will also try to conform whether TAM inhibit function of CD8+T cells or not. TAM and CD8+T will be sorted and co-cultured in vitro, and cytokines expression levels will be determined. On another way, we will inhibit TAM by mono antibody in vivo, then check and compare tumor formation and progression in different genotype mice. Through these experiment we will clarify the role of TAM on gastric cancer development. Thus, our study will give new approaches and evidence for the treatment of gastric cancer. And this research will also provide more information about blocking PD-1for gastric cancer treatment to improve cancer therapy effect.

目前阻断 PD-1 等免疫抑制受体成为肿瘤免疫治疗的热点。如何更好地控制 PD-1 阻断引起的炎症损伤和提高抗肿瘤疗效是迫切需要研究和解决的问题。而当前国内外尚未见有关胃癌中阻断 PD-1 的研究报道。我们前期利用胃癌小鼠模型发现 PD-1 敲除后胃癌浸润 CD8+T 细胞显著增加，但是肿瘤并未消退；同时发现 TAM 增多。因此我们将通过对小鼠胃癌进行详细的病理组织学分析，对胃癌浸润细胞进行流式细胞分析并检测细胞因子表达种类和水平来明确 PD-1 敲除对肿瘤微环境炎症相关细胞分布和功能的影响；同时将通过体外和体内途径来检测 TAM 对 CD8+T 细胞抗肿瘤能力的抑制和胃癌发生发展的影响，找到 PD-1 敲除后肿瘤没有消退的原因，探讨抑制 TAM 来提高 PD-1 阻断疗法的疗效的可行性。为更好地控制 PD-1 阻断引起的炎症损伤和提高胃癌 PD-1 阻断治疗的疗效提供思路和依据。

胃癌患者的临床转归和预后与胃癌组织表达 PD-L1 水平密切相关。我们的前期的工作发现胃癌小鼠模型肿瘤浸润间质细胞中，PD-1 表达水平显著增加，进一步提示 PD-1/PD-L1 通路对胃癌生成发展中具有重要的影响。因此我们利用胃癌小鼠模型，进一步检测 PD-1 缺失对肿瘤微环境中炎症相关细胞分布及功能的影响；明确 TAM 等细胞是否抑制了 CD8+T 细胞的抗肿瘤能力；检测TAM被抑制后是否促进 pd1−/−Gan 小鼠胃癌消退。我们主要从四个方面展开研究 并取得进展如下：（1） 研究PD-1 敲除对小鼠胃癌生成的影响；在小鼠模型中pd1−/−WT小鼠胃粘膜出现病理性增生，数据显示30周龄小鼠炎症模型pd1−/−C2mE胃粘膜的炎症性增生比 pd1+/+C2mE 显著，胃癌模型中pd1−/−Gan 比pd1+/+Gan 肿瘤生长增加，提示pd1敲除在小鼠模型中可能具有促进胃癌的发生发展的作用。（2) 研究 PD-1 敲除对小鼠胃癌炎症微环境的影响；在小鼠模型中pd1敲除后，改变了胃癌组织的炎症微环境，加重了胃癌组织炎症反应。CD4+T，CD8+T及TAM等炎症细胞增加，其中M2型巨噬细胞增加显著；TNFɑ，IL-17等症因子的表达增加，同时部分炎症因子表达水平下调，而加重的炎症微环境可能促进了胃肿瘤组织的发生发展。（3）阐明 TAM 对胃癌生发生发展所起的作用以及可能的机制；用单克隆抗体抑制 pd1+/+ Gan 和 pd1−/−Gan小鼠 TAM 后，两种基因型小鼠肿瘤均消退，但pd1+/+ Gan 和 pd1−/−Gan小鼠差异不明显，提示TAM 对胃癌的发生发展具有一定的促进作用，但pd1−/−Gan 小鼠中， CD8+T细胞的增加不足以抵制TAM ，Treg及 MDSC 等细胞及相关细胞因子对肿瘤的促进作用。提示在临床治疗时，要充分考虑抑制PD-1对整个炎症微环境的影响，必要时联合抗炎治疗可以提高PD-1单抗 的治疗效果。（4) 研究PD-1/PD-L1信号通路与胃癌发生发展及炎症微环境的影响；胃癌组织中PD-L1表达水平增加，约35%胃癌患者细胞表达的PD-L1，PD-L1-CD8hi的患者预后较PD-L1+CD8low好，提示PD-L1的表达水平结合胃癌浸润的淋巴细胞TILs有助于判断胃癌患者的预后。通过该项目研究为提高肿瘤免疫治疗效果提供一些新的思路