雌性生殖道液体微环境Testisin水平及其与阳虚不孕的关系研究

We have previously detected Testisin expression in blood cells of infertile women with Yang deficiency by using the gene chip technique. It has been demonstrated that Testisin gene is mainly expressed in testis and on sperm membrane. However, no study has been reported so far that the gene expression is associated with female reproduction. In this study, first at all, we will establish a mouse model of Yang deficiency, a Testisin siRNA interference mouse model and an anti-Testisin mouse model. After that, by using techniques of fluorescence in situ hybridization, immunohistochemistry and Western Blot combined with the acrosome reaction of sperm and sperm penetration test, we will determine the Testisin expression level in the female mouse reproductive tract fluid microenvironment and its impact on the reproductive capacity of male mice. At the same time, we will investigate the effect of reproductive tract fluid microenvironment of Testisin siRNA interference and anti-Testisin on sperm fertilizing capacity. Finally, we will explore the relationship between Testisin/Testisin antagonist and Yang deficiency of infertility through the two kinds of mice reproduction ability, as well as reproductive function in female mice and its mechanisms. As the result of the research, the detection of level of Testisin in blood and/or reproductive tract fluids with ELISA in normal and infertile women with Yang deficiency will lay the foundation for future development of diagnostic reagent.

提高妊娠率是生殖医学研究的热点和难点，前期采用基因芯片技术在不孕（阳虚证）妇女血液细胞中检测出Testisin。该基因主要表达在睾丸以及精子膜上,迄今，尚未见该基因表达与女性生殖相关的研究报道。本研究拟建立阳虚动物模型、Testisin的siRNA干扰小鼠模型、抗Testisin小鼠模型，同时采用荧光原位杂交、免疫组化、Western Bloting等技术，结合精子顶体反应和精子穿卵试验等，探讨阳虚雌性小鼠生殖道液体微环境中的Testisin水平及其对小鼠生殖能力的影响；研究siRNA干扰小鼠和抗Testisin小鼠生殖道液体微环境对精子受精能力的影响，通过两种小鼠生殖繁育能力,探讨Testisin以及拮抗Testisin与阳虚不孕的关系，及与雌鼠生殖功能的关系及机制等。采用ELISA等技术开展正常与阳虚不孕妇女体液（血液、生殖道液）Testisin水平检测，为今后研究诊断试剂奠定基础。

Testisin(也称为PRSS21)是一种膜锚定丝氨酸蛋白酶，参与附睾精子成熟和精子受精能力。我们通过人体临床试验和小鼠动物实验研究，完成了“雌性生殖道液体微环境testisin水平及其与阳虚不孕的关系”的自然基金课题研究。结果(1）:收集人宫腔、输卵管等生殖道液体，用ELISA方法未能检测出游离的testisin。但采用同样方法可检测人血清testisin水平，但进一步研究显示，testisin水平在阳虚质不孕与平和质妇女之间没有显著差异。但我们发现，某些不明原因的不孕妇女血清testisin水平显著高于正常生育妇女。进一步通过qPCR技术检测人外周血细胞testisin的mRNA表达，并进一步比较了阳虚质不孕与正常平和质妇女存在外周血testisin基因的差异表达，结果与正常平和质妇女比较，阳虚质不孕妇女外周血testisin基因表达呈现下调趋势。基于此结果，我们进一步通过羟基脲诱导雌性小鼠阳虚不孕，用qPCR技术分析和比较了阳虚不孕小鼠与正常生育小鼠外周血细胞testisin基因表达，以及小鼠血清循环的testisin水平，结果2）：羟基脲诱导的雌性小鼠阳虚不孕，其testisin基因表达呈现下调趋势，与临床阳虚不孕妇女的检测结果一致。但是，通过对testisin基因敲出小鼠分析比较，纯和型小鼠（或杂合型小鼠）与野生型小鼠比较，未观察到阳虚证候的表型，生育能力也不受基因敲出与否而改变。意料之外的结果显示3）：我们进一步检测了局部生殖组织的testisin基因表达，发现羟基脲诱导不孕小鼠卵巢明显受损，但testisin基因表达无明显改变。但是，羟基脲诱导不孕小鼠的子宫内膜厚度明显变化，且伴随子宫testisin基因表达上调，提示testisin基因可能参与子宫内膜发育、容受性和胚胎着床等的调控。.结论：雌性生殖道液体微环境中无游离水平的testisin，提示testisin以完整的GPI锚形式存在于组织细胞表面；阳虚质不孕与正常平和质妇女之间人外周血细胞testisin基因表达差异显著，呈现明显的下调趋势；Testisin基因在子宫组织的表达差异并伴随子宫内膜厚度的改变，局部testisin是否参与调控子宫内膜发育、子宫容受性和胚胎着床是值得深入探讨的新的课题。