抗立氏立克次体表位疫苗的研究

Rickettsia rikettsii is the pathogen of Rocky Mountain Spotted Fever, RMSF), a lethal infection; the surface proteins of R. rikettsii, including outer membrane protein (Omp)A and OmpB as well as Adr2 and YbgF identified in our laboratory, are protective antigens due to the fact that they have a capability to elicite cell-mediated immunoresponses against R. rickettsii.In this study, The epitopes of Th and CTL in these protective antigens will be searched by computer analyses and the T cell epitope peptides will be synthesized; The synthesized epitope peptides that can elicite immunoresponses of Th1 type or CTL will be screened in vitro by flow cytometry and ELISPOT; the epitope peptides having a capability to activate CD4+ and/or CD8+ T cells to produce high levels of IFN-γ will be used to immunize HLA-DR1 and HLA-A 2.1 trangenic mice, respectively, and then the immunized mice will be challenged with R. rickettsii to screen protective epitope peptides.These identified protective epitopes with high affinity for human MHC I or MHC II will be properly combined to immunize human MHCI- and MHCII-expressing transgenic mice and the protective efficiency of the epitope-based vaccines against R. rickettsii will be evaluated and their protective mechanisms will be investigated.

立氏立克次体是致死性感染- - 落基山斑点热的病原体；立氏立克次体具有主要保护性抗原外膜蛋白A（OmpA）和外膜蛋白B（OmpB）以及在我们实验室首次发现的新保护性抗原Adr2 和YbgF表面蛋白。研究已证明它们的免疫保护机制主要是诱导特异性细胞免疫应答。本项目将通过生物信息学分析，发现立氏立克次体保护性抗原的Th 和CTL表位，并合成表位短肽；通过流式细胞技术和酶联免疫斑点（ELISPOT）等技术筛选能激活CD4+ 或 CD8+T淋巴细胞去产生高水平IFN-γ的表位肽；将筛选出阳性表位肽分别免疫HLA-DR1和HLA-A 2.1转基因小鼠，然后立克次体攻毒筛选具有免疫保护力的Th1、CTL细胞表位肽。将这些将具有良好免疫保护力的Th1、CTL表位肽适当组合去免疫HLA-A2/ DR1双转基因小鼠、用立氏立克次体攻毒后评价多表位肽联合免疫的保护效能和分析特异性免疫应答去探讨其免疫保护机制。

立氏立克次体（Rickettsia rickettsii, Rr）是专性细胞内寄生菌，为落基山斑点热的病原体。通过生物信息学方法预测了Rr的7个主要免疫蛋白(MIPs)的150条CD4+ T细胞表位肽（TCEP）。采用酶免疫斑点法（ELISPOT）鉴定9条能诱导Rr感染小鼠CD4+ T细胞分泌IFN-γ的免疫优势CD4+ TCEP。将编码6条免疫优势CD4+TCEP嵌合基因插入质粒中，制备出CD4+ T细胞表位重组蛋白(TCERP)。用TCERP免疫小鼠，Rr攻击后，免疫小鼠肺组织的Rr载量显著小于单个表位肽免疫小鼠，其肺、肝、脾组织的病理损伤也显著轻于对照。血清分析发现TCERP诱导小鼠产生高水平特异性抗体，血清中和实验证明特异性抗体能够抑制Rr对人血管内皮细胞的粘附和入侵。CD4+ TCERP诱导Rr感染小鼠CD4+ T细胞产生高水平的IFN-γ 和 TNF-α，说明其能够诱导小鼠产生Th1型免疫应答。通过生物信息学方法从11个Rr效应蛋白中预测101条CD8+ TCEP，从7个MIPs中预测了93条CD8+ TCEP。ELISPOT分析显示源自效应蛋白的8条CD8+ TCEP诱导Rr感染小鼠CD8+ T细胞分泌高水平IFN-γ。而源自MIPs的CD8+ TCEP均未能诱导该CD8+ T细胞分泌IFN-γ，表明活Rr在宿主细胞内分泌的效应蛋白能够有效激活机体的CD8+ T细胞。减毒单核细胞增生性李斯特菌（Lm）能够诱导机体产生强烈的细胞免疫应答，为优秀疫苗载体。将编码立氏Rr的4个CD4+ TCEP和8个CD8+ TCEP的嵌合基因插入穿梭质粒，构建Rr表位重组李斯特菌（Lm-Rr）。用Lm-Rr菌免疫小鼠，ELISPOT分析发现4条CD4+ TCEP均能诱导Lm-Rr菌免疫小鼠CD4+ T细胞分泌IFN-γ，5条CD8+ TCEP能够诱导Lm-Rr菌免疫小鼠CD8+ T细胞分泌IFN-γ，证明Lm-Rr在小鼠体内表达了这些免疫优势T细胞表位，表达的表位大多数被有效呈递去激活T细胞。用致死剂量的Rr攻击Lm-Rr菌免疫小鼠14天后，Lm-Rr菌免疫组小鼠的生存率为80%，显著高于Lm菌免疫小鼠（40%）和PBS模拟免疫小鼠（0%），提示Lm-Rr菌免疫能够提供小鼠抵御致死剂量Rr感染的免疫保护。