贝氏柯克斯体细胞表面蛋白鉴定及其功能研究

贝氏柯克斯体是Q热病原体，为重要生物战剂/生物恐怖剂。本课题拟将生物素标记与蛋白质组学技术相结合分离、鉴定贝氏柯克斯体菌体表面蛋白，基于贝氏柯克斯体全基因组测序发现这些表面蛋白的基因，结合生物信息学分析阐述这些菌体表面蛋白的功能，通过细胞生物学和免疫学方法研究贝氏柯克斯体表面蛋白抗原与宿主细胞、与免疫活性细胞的相互作用。研究成果将为阐明贝氏柯克斯体的致病与免疫机制提供理论依据，为Q热的诊断试剂、预防疫苗、治疗药物研发提供候选分子靶标。

贝氏柯克斯体是全球性人兽共患病——Q热的病原体。我们采用生物素标记与链霉菌亲合素亲和层析方法纯化贝氏柯克斯体菌体表面蛋白，纯化的表面蛋白经双向电泳分离后再做质谱分析，首次鉴定了37种贝氏柯克斯体表面蛋白。将贝氏柯克斯体重组表面蛋白制备蛋白芯片与贝氏柯克斯体实验感染小鼠血清以及Q热患者血清反应，发现其中13种蛋白具有良好的血清反应性和特异性：它们与50%以上的贝氏柯克斯体感染小鼠血清阳性反应、但不与立氏立克次体、黑龙江立克次体、斑疹伤寒立克次体感染小鼠血清发生阳性反应；它们与Q热患者血清阳性反应、但不与布氏杆菌或肺炎支原体感染患者血清发生阳性反应。另外，我们研发了一张由101个贝氏柯克斯体的毒力相关重组蛋白构成亚基因组蛋白芯片。将贝氏柯克斯体感染小鼠血清及Q热患者血清与该芯片做血清学分析。结果小鼠血清鉴定出16个血清反应阳性蛋白, 其中有7个蛋白质能够与至少45%的Q热患者发生血清反应。我们的研究提示这些血清学反应阳性的贝氏柯克斯体蛋白可以是Q热血清学诊断和亚单位疫苗研发的候选靶标。 .黑龙江立克次体为远东斑点热病原体,T细胞免疫球蛋白粘附分子3（Tim-3）在立克次体宿主细胞——血管内皮细胞上表达。我们研究Tim-3在小鼠体内和在体外血管内皮细胞上表达与立克次体感染的相关性。研究发现Tim-3信号通路封闭小鼠脾脏立克次体数量显著高于对照小鼠，而该小鼠血清IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-18等细胞因子和趋化因子RANTES的水平则显著低于对照小鼠。另外，用黑龙江立克次体感染Tim-3高表达的转基因小鼠，感染后3天转基因小鼠无感染表现，而对照小鼠则出现明显感染表现，并且转基因小鼠脾脏立克次体载量显著高于对照小鼠；同时转基因小鼠血清细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-18和趋化因子RANTES的水平显著高于对照小鼠。用立克次体感染人Tim-3 单抗封闭的人血管内皮细胞、Tim-3低表达或高表达人血管内皮细胞，结果显示封闭了Tim-3信号通路和Tim-3低表达血管内皮细胞的立克次体数量显著高于对照细胞，而Tim-3高表达的血管内皮细胞的立克次体数量则显著低于对照细胞。我们的研究首次证明体内Tim-3高表达并通过细胞内Tim-3信号通路激活血管内皮细胞，激活细胞产生高水平的杀菌相关因子去抑制或杀伤细胞内的立克次体。