14-3-3蛋白在橡胶树幼态无性系高产中的分子机制

橡胶树幼态无性系是一种新型的种植材料，具有生长速度快、产胶量高、抗逆性强的特点。目前对橡胶树幼态无性系高产的研究仅限于形态学观察、排胶生理参数等而缺乏直接的遗传、分子生物学等方面的证据，在一定程度上限制了橡胶树幼态无性系在生产中的应用和大面积推广。我们通过抑制缩减杂交获得了2个编码14-3-3蛋白的基因（命名为HbGF14a和HbGF14b），HbGF14a在幼态无性系中的表达明显的比老态无性系中低，HbGF14b在幼态无性系中的表达明显的比老态无性系中高。本项目拟采用生物化学和分子生物学相结合的研究手段，对HbGF14a和HbGF14b在幼态无性系和老态无性系差异表达的原因分析和功能鉴定，探讨14-3-3蛋白对天然橡胶合成中的调控作用，进一步了解橡胶树幼态无性系高产的分子机制，为橡胶树幼态无性系种植材料的推广和应用提供理论基础。

利用GenomeWalker的方法克隆了橡胶树两个14-3-3蛋白基因HbGF14a和HbGF14b翻译起始位点上游1466 bp和986 bp的启动子片段， 两片段中A/T含量高达77.39%和74.25%，符合真核生物启动子序列的特征。在HbGF14a 242 bp GC丰富的区域内有5个甲基化位点， HbGF14b 271 bp GC丰富的区域内有5个甲基化位点，这些甲基化位点差异可能是HbGF14a和HbGF14b在橡胶树幼态无性系和老态无性系中差异表达的原因。克隆了橡胶树蔗糖磷酸合成酶基因HbSPS1，证实了HbGF14a蛋白和蔗糖磷酸合成酶存在相互作用，表明HbGF14a可能通过与蔗糖磷酸合成酶的相互作用调节蔗糖的合成，从而影响橡胶的生物合成。. 通过酵母双杂交获得了在橡胶树胶乳中与HbGF14a和HbGF14b相互作用的18个蛋白。这些蛋白按功能分成胶乳代谢、氧化应激、蛋白/DNA/RNA结合蛋白、信号蛋白、碳水化合物代谢、蛋白酶体相关蛋白、未知蛋白七大类。实验数据分析表明HbGF14a可能通过与转录因子HbRZF的相互作用来调控天然橡胶的生物合成，HbGF14b可能通过与橡胶小粒子蛋白的直接作用参与天然橡胶的生物合成的调控。. 通过双向电泳获得了橡胶树自根幼态无性系和供体老态无性系胶乳中37个差异表达蛋白。经MALDI-TOF-MS鉴定，其中24个蛋白得到成功的鉴定，这些蛋白在橡胶树自根幼态无性系中13个上调表达，11个下调表达。这些蛋白的功能主要集中在碳水化合物和能量代谢，次生代谢，信号转导，转录调控，蛋白质合成组装和降解，运输，核酸过程，质膜代谢等，并对相关蛋白进行了研究。这些差异表达的蛋白获得将有助于进一步了解橡胶树自根幼态无性系和供体老态无性系之间差异产生的分子机制。