青蟹呼肠孤病毒（MCRV）结构蛋白鉴定及其感染和装配功能

拟穴青蟹是我国海水养殖的重要种类，青蟹呼肠孤病毒（Mud crab reovirus, MCRV）是新近发现的对拟穴青蟹高度致死的病原，发病池塘拟穴青蟹死亡率约60%，严重影响了我国青蟹养殖产业。本项目拟通过对MCRV结构蛋白的鉴定、结构蛋白相互作用、结构蛋白在病毒粒子中的解析、结构蛋白对病毒侵染的影响等研究，确定病毒侵染关键结构蛋白和装配关键蛋白，同时为进一步开展MCRV侵染机制、装配机制和逃避蟹类非特性免疫机制等研究奠定基础，也可为开发有效药物提供靶标。

拟穴青蟹Mud crab((Scylla paramamosain) 是我国东南沿海地区重要的海水养殖品种，病毒是拟穴青蟹养殖过程中的主要病原，其造成青蟹养殖业的严重经济损失。2004年始在珠海发现患“嗜睡病”（SD）的拟穴青蟹分离出两种大小不同的病毒，较大的病毒直径为60-70nm，经DNA酶及RNA酶消化后确定为双链RNA病毒，基因组由12节段的双链RNA组成，属于呼肠孤病毒科，暂命名为：青蟹呼肠孤病毒（mud crab reovirus, MCRV）。较小的病毒直径为20-30nm，经DNA酶及RNA酶消化后确定为单链RNA病毒，基因组由一条单链RNA组成，全基因组测序完成后，经过分析，具有双顺反子病毒科的特征，暂命名为青蟹双顺反子病毒（Mud crab dicistrivirus, MCDV）是单股正链RNA病毒ssRNA(+)。这两种病毒对拟穴青蟹都有很强的致病性。经过多年的流行病学调查和分析发现死亡的青蟹体内两种病毒几乎同时存在，在多种水生动物体内发现呼肠孤病毒与其他病毒共存的现象。推测两种病毒在宿主中存在相互关系。.本项目通过利用冷冻电镜单颗粒技术和三维重构方法对MCRV 进行研究，获得了MCRV完整颗粒3.1 Å三维结构，显示其衣壳分两层：无塔状突起（non-turreted）的T=13外层衣壳和T=2的内层衣壳。外层衣壳包含了形成表面小突起的同源三聚体蛋白S12、衣壳表面六邻体中央蛋白S11；内层蛋白S3有两种构象A和B；5次轴顶点下方的 RNA聚合酶S1。每个病毒衣壳共有260个S12三聚体、120个内层衣壳蛋白S3（构象体A、B各60个）以及120个六邻体中央蛋白S11。.通过酵母双杂交技术我们发现MCRV 的结构蛋白S11、S12与MCDV的结构蛋白VP1有相互作用；又分别进行MCRV 的结构蛋白S11和MCDV的结构蛋白VP1及MCRV 的结构蛋白S12和MCDV的结构蛋白VP1免疫共沉淀实验；利用RNAi技术沉默MCRV的结构蛋白S9、S11、S12或MCDV的结构蛋白VP1和VP3基因，观察到沉默了MCRV的结构蛋白S9、S12和MCDV的结构蛋白VP1、VP3基因，相比对照组能够降低潜伏感染了MCRV的拟穴青蟹累计死亡率，结果表明MCRV和MCDV的复制存在相互影响。