mTORC2复合体的结构和功能研究

Rapamycin-sensitive mTORC1 and Rapamycin-insensitive mTORC2 are two important complexes in mTOR signaling pathway. The two complexes differ in subunits and function, but both of them are related with cell growth and are abnormal in many cancer progresses. Due to their important function, they are treated as drug targets. Thus the structures of two complexes are of important significance for their function and special drug design. The applicant dissolved the 4.4Å resolution structure of mTORC1 by cryo-electron microscopy (cryo-EM) (Protein & Cell，2016). This project aims to resolve mTORC2 structure to elucidate the underlying molecular mechanism of its subunits assembly, substrate recognition and insensitivity of rapamycin by Cryo-EM and biochemistry studies. We have purified the active mTORC2 protein from mammalian cells expression system and got 6.9Å resolution mTORC2 density map and partial structure model. We will try to improve the resolution to nearly atomic level. This project will not only reveal the structure and biological function of mTORC2, but also deepen our understanding of mTOR signaling pathway.

mTOR蛋白激酶存在于两种重要复合体中，分别是对雷帕霉素(Rapamycin)敏感的mTORC1和不敏感的mTORC2。两种复合体的组分和功能有所不同，但都与细胞的生长增值相关，在多种肿瘤的发生进程中异常表达，是重要的药物靶点，因此两者的结构研究非常重要。申请人前期解析了4.4Å分辨率mTORC1复合体冷冻电镜结构（Protein & Cell，2016）。本项目拟利用冷冻电镜技术结合生物化学等手段研究mTORC2复合体的结构和功能，阐明其组装方式、底物识别及其对Rapamycin不敏感的分子机制。目前已经获得高纯度mTORC2复合体蛋白，通过冷冻电镜技术获得了6.9Å分辨率的密度图及部分模型，拟通过本项目支持，获得近原子分辨率模型（≈4Å），揭示mTORC2的结构和功能，加深对mTOR信号通路的理解。

该项目获得了mTOR信号通路中mTORC2复合体的冷冻电镜结构，通过结构与生化分析，发现mTORC2复合物呈现中空棱形的二次对称结构，Rictor和mSin1共同作用，紧密结合到mTOR形成的核心二聚体，并阻碍FKBP-Rapamycin结合到mTOR，揭示了mTORC2对Rapamycin不敏感的机理。Rictor在mTORC2中结合mTOR的位点与Raptor在mTORC1中结合mTOR的位点有广泛的重合，由此说明两种复合物的存在是不相容的。上述研究为mTORC2的结构和功能分析奠定了结构基础(Cell Research, 2018)。该研究成果获得了国际专业评估F1000的评价，认为我们的研究对mTORC2的结构认识起了很大的推动作用。.此外，利用该基金的资助，申请人也对结节性硬化症蛋白复合体(Tuberous Sclerosis Complex, 简称TSC复合体)进行了研究。TSC复合体是mTORC1信号通路中重要的蛋白质复合体，其整合细胞外各种因素的刺激，负调控mTORC1复合体的活性，起到肿瘤抑制的作用。TSC复合体包含三个亚基：TSC1，TSC2以及TBC1D7。其中TSC2包含一个GTP酶活化蛋白（GTPase activating protein，简称GAP）结构域，将GTP形式的Rheb水解为GDP形式的Rheb，导致Rheb失活，不能激活mTORC1的激酶活性，抑制细胞生长。该项目解析了人源TSC复合体的结构，发现复合体中三个亚基(TSC1, TSC2和TBC1D7)以2:2:1的比例构成，整体复合物呈现独特的弓形结构。TSC1的Coiled-coil二聚体形成交错的长螺旋结构，跨在TSC2通过尾部(tail-to-tail)结合的二聚体一侧，TBC1D7结合在TSC1的C端Coiled-coil位置。通过结构分析和生化研究解释了TSC2对底物Rheb发挥GAP活性的催化机制，并对两者之间结合的重要位点进行了验证。TSC2的1643位天冬酰胺稳定GTP的γ-phosphate，加速Rheb中GTP的水解。该研究还总结了一些关键突变位点，对其导致疾病的机制进行了分析 (Nature Communications, 2021)。该研究成果也获得了国际专业评估F1000的评价，认为我们的研究对认识TSC复合体的分子组装机制起了大的促进作用。