IFT复合体中新组分的鉴定和功能研究

Cilia/flagella are hair-like organelles protruding from the surface of most eukaryotic cells and play important roles such as cell motility, sensory reception and signaling. Their assembly and disassembly required a conserved molecular mechanism, Intraflagellar Transport (IFT). IFT complexes are composed of at least 20 IFT proteins based on previous research. However, the traditional method of IFT proteins identification was dependent on the temperature sensitive kinesin-2 mutant fla10, and only compared the proteins of the 16S fraction in ciliary matrix. Recent transmission electron microscopy observations and cilia assembly mutants identified in other cilia models suggested that there may be more IFT proteins undiscovered in the IFT complexes. In this proposal, we will perform 15N in-vivo labeling and high resolution mass spectrometry analysis in order to quantify the ratio of known IFT proteins and other ciliary proteins when IFT particles was disappeared in cilia. Then, we will screen putative IFT proteins with similar pattern of known IFT proteins, and analyze the movement of 1-2 new IFT proteins and their interactions to known IFT proteins. We will also analyze their role on cilia assembly and disassembly after obtaining their knockdown or inserted mutants. This work will improve our understanding of the molecular mechanism of IFT in eukaryotic cells.

纤毛/鞭毛是一类突出于大多数真核细胞表面的毛发状细胞器，具有运动、环境感知和信号传导等重要功能。纤毛的形成和解聚必须依靠保守的纤毛内运输机制（Intraflagellar Transport, IFT）。IFT由IFT蛋白和分子马达组装而成，目前已鉴定出IFT蛋白20个。传统鉴定策略以IFT分子马达温敏突变体fla10为材料，比较纤毛基质中16S组分的差异。近年来，不同物种中纤毛形成的突变体研究以及IFT电镜观察结果显示，IFT复合体中可能还存在未知的IFT蛋白。本项目将利用15N体内标记技术和高分辨率质谱，比较IFT停止前后纤毛中蛋白组成的差异，根据已知IFT蛋白的变化规律，寻找特征类似的潜在IFT蛋白，并研究1-2个新IFT蛋白在纤毛内的运动特征，它们与已知IFT蛋白的互作关系以及新IFT蛋白敲降或突变后对纤毛形成和降解的影响，从而促进对IFT组成和运输机理的全面认识。

纤毛/鞭毛是一类突出于大多数真核细胞表面的毛发状细胞器，具有运动、环境感知和信号传导等重要功能。纤毛蛋白依赖纤毛内运输机制（Intraflagellar Transport, IFT）从胞体运输至纤毛。传统生化方法已鉴定得到17个衣藻IFT蛋白，但对纤毛模式生物线虫和斑马鱼的研究显示仍有新IFT存在。.在国家自然科学基金的资助下，我们以温敏突变体fla10为研究对象，利用定量蛋白质组学方法定量分析IFT停止前后长/短纤毛蛋白质组变化，鉴定得到9个较为保守的候选IFT蛋白，它们的变化特征与已知的IFT高度一致，其中有3个蛋白具有典型的ankyrin重复结构域。在获得衣藻突变体之前，为了研究此类ankyrin-repeat蛋白在纤毛中的功能，我们选取纤毛模式生物线虫为研究对象。unc-44是线虫ankyrin基因，其突变体CB362具有典型的dye-filling缺陷，而且由于distal segment缺失，CB362突变体纤毛长度较野生型显著缩短。利用条件性敲除突变体，我们确认unc-44基因突变能够产生纤毛缺陷。活体显微成像分析显示，仅具有ankyrin-repeat的可变剪接体UNC-44g::GFP定位于纤毛middle segment。然而意外的是，在UNC-44 N端GFP knock-in线虫中，GFP::UNC-44对应的Giant Ankyrin仅定位于纤毛外围的胶质细胞中。该部分工作为后续研究ankyrin-repeat蛋白在纤毛中的功能打下了基础。.为了获得候选IFT的衣藻突变体，我们构建了包含15万突变体的随机插入突变体库。该文库可同时用于正向和反向遗传学筛选需要的突变体。目前，利用PCR我们筛选得到27个突变体，涉及20个基因，涵盖鞭毛、糖基化和淀粉合成等功能。我们还筛选得到967个鞭毛缺陷突变体，其中22个突变体表现为IFT基体定位缺陷。另外，利用缺氮后荧光染料染色筛选得到929株油滴形成缺陷型突变体。该突变体文库为后续研究衣藻基因功能提供了较高效的突变体筛选平台。.