苹果属四倍性皱叶矮生株系的生殖特征及其形成机理研究

本研究以苹果属无融合生殖能力极强的平邑甜茶与携有矮生主基因的扎矮山定子杂交所得的36株珍贵的四倍性皱叶矮生型成龄树为试材，通过套袋自交和后代实生苗（F2代）倍性鉴定的方法在评价并确定这些株系无融合生殖能力基础上，选择18个不同无融合生殖能力的株系利用激光扫描共聚焦显微镜等方法观测和记录这些株系的胚胎发育特征；在比较和分析基础上通过对各类株系和亲本在胚胎发育关键时期如大孢子母细胞形成期和无性单核胚囊出现期进行田间取样和RNA样品制备，采用mRNA差异显示和抑制差减杂交的方法获得使无融合生殖习性保持或解体的基因或基因片段，以便从分子生物学角度探索这些株系所表现的生殖特征的发生机理。一旦获得了苹果属无融合生殖性状的控制基因或解体基因，都将为苹果属无融合生殖特性的鉴定、转移和应用提供有意义的参考，也能为预选既矮化又具有无融合生殖能力的苹果砧木资源提供依据。

“苹果属四倍性皱叶矮生株系的生殖特征及其形成机理研究”项目的执行期为2010年1月到2012年12月，经过几年的探索，获得了多项新的研究成果。具体成果如下：1、根据两年切柱头处理的坐果率、采果率和平均单果种子数的调查结果，26株四倍性皱叶矮生株系的无融合生殖能力由高到低的顺序为31、49、28、5、10、21、26、9、16、19、39、46、25、1、12、11、15、7、33、18、17、45、4、42、8和40；其中31#株系的坐果率为42.57%、采果率为25.55%、单果平均种子数为1.17。根据对20株四倍性皱叶矮生株系早期胚胎发育过程的观测，发现各株系均表现出明显的有性生殖特点、极少存在多胚囊现象。事实上，所有36株四倍性皱叶矮生株系均以有性生殖为主。2、首次在苹果属植物中发现了4个SERK基因并完整克隆了三倍性平邑甜茶的SERK1基因即MhSERK1（GenBank登录号JQ231272，CDS全长1899bp）和四倍性皱叶矮生株系33#的SERK1基因即MhdSERK1（GenBank登录号JQ231273,CDS全长1881bp）；确定了2个基因之间的同源率为99.95%，确定了前者比后者多了从696到714位的18个核苷酸，具体序列为 “ggc att gca tct tta gtt”。3、确定了MhSERK1的DNA全长为6886bp、MhdSERK1的DNA全长为6719bp；确定了基因结构中有11个外显子和10个内含子，其中内含子3的长度最长、达1695bp。4、利用实时定量PCR技术发现：SERK1基因在四倍性皱叶矮生株系28#、45#和二倍性扎矮山定子、普通山定子植株的不同器官和不同时期都有表达，但表达强度不同、规律性不明显。5、利用实时定量PCR技术探索了SERK1基因和SERK2-4基因片段在33#株系和平邑甜茶不同花器官的表达特性，结果表明：MhSERK1在33#株系和平邑甜茶子房中的表达量均以盛花后最高、花蕾期中等、盛花期最低；MhSERK2-4在平邑甜茶子房中表达量均在花后2天最高，而在33#株系花后2天子房的表达量却很低。此外，SERK1-4在33#株系和平邑甜茶的盛花期子房、萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊和叶片中均有表达，但表达强度和趋势不同。6、构建了植物表达载体pBI121-MhSERK1 和pBI121-MhdSERK1。