苹果同源四倍化后植株矮生的分子机理研究

植物多倍体基因组进化是分子生物学研究的热点，但同源多倍化后植株表型差异的作用机制尚不清楚。本项目先期诱导出二倍体'寒富'苹果的同源四倍体植株，发现四倍体较二倍体植株矮生。通过抑制消减杂交技术在四倍体上调表达文库中发现在拟南芥中过表达导致植株矮化的BKI1基因的同源序列。在此基础之上拟通过染色体步移与RACE技术相结合的方法获得'寒富'苹果BKI1基因全长及启动子序列；采用转基因技术获得BKI1基因过表达的二倍体植株和BKI1基因沉默的四倍体植株；比较分析二者的生物学性状，揭示苹果同源四倍化后植株矮生与BKI1基因上调表达的关系；同时采用重亚硫酸盐直接测序技术对二倍体及其四倍体苹果的BKI1基因进行DNA甲基化测定，探讨同源四倍化后BKI1基因上调表达与DNA甲基化的关系。本项目旨在探索苹果同源多倍化过程中植株矮生的分子机制，研究成果将丰富植物基因组进化理论，并为苹果多倍体育种提供理论指导。

植物多倍体基因组进化是分子生物学研究的热点，但同源多倍化后植株表型差异的作用机制尚不清楚。本项目前期诱导了‘寒富’苹果同源四倍体植株，发现其表现明显的矮化特性，为探究同源加倍后植株矮化的分子机理，项目组前期通过抑制消减杂交技术发现了四倍体中，可能导致植株矮化的BKI1基因明显上调表达。在此基础上，借助苹果基因组数据库通过生物信息学分析，经PCR扩增获得了1206 bp的苹果BKI1基因全长序列及其启动子序列。采用转基因技术获得了苹果BKI1基因的3个过表达及6个沉默株系和烟草中异源表达苹果BKI1基因的8个转基因株系。形态学调查显示，在苹果中BKI1基因的3个过表达株系均显著矮化和节间变短而6个BKI1沉默株系均显著增高和节间伸长；在烟草中异源表达苹果BKI1基因的8个转基因株系均表现矮化趋势。初步揭示了，苹果同源多倍化植株矮生与BKI1基因上调表达相关。之后采用重亚硫酸盐直接测序技术对‘寒富’苹果及其同源四倍体BKI1基因启动子区域进行DNA甲基化测定，并未发现此区域发生DNA甲基化变化，因此推测同源加倍过程中BKI1的上调表达可能与DNA甲基化调控无关。.我们同时研究了四倍体矮化与BR、IAA及GA含量的关系，通过高效液相色谱的测定发现GA含量差异不显著，而BR和IAA的含量差异较大。而通过数字表达谱技术对‘寒富’苹果及其同源四倍体进行差异表达基因分析，发现在BR和IAA生物合成途径和信号转导途径中存在导致四倍体矮化的差异表达基因，而在GA生物合成和信号转导途径中并未发现差异表达基因。从转录水平上分析，初步认为四倍体矮化可能与BR和IAA的调控有关。同时我们有了一个新的发现来解释同源四倍体矮化现象，同源加倍过程中miRNA390及MdTAS3的积累导致二者表达量增加从而负调控了ARF3的表达（图7），干扰了IAA信号转导途径。本项目率先揭示了苹果BKI1基因的矮化功能；其次在转录水平的分析，初步判断苹果同源四倍化后植株矮化可能与BR和IAA的调控有关；最后在小RNA水平上找到了同源四倍化后植株矮化的新证据；为同源多倍体基因组进化的分子研究奠定基础，为苹果多倍体育种提供了理论指导。本项目在期刊上已发表论文2篇，已录用1篇，尚在投稿中的待发表论文3篇均投稿SCI收录期刊；申请发明专利2项其中1项已经授权；项目在研期间获得山东省科技进步二等奖1项。