TLR9-MyD88-PI3K-Akt-NF-κB 通路调控嗜酸粒细胞凋亡延迟参与哮喘发病的分子机制

The accumulation of eosinophil is the hallmark of asthma，apoptosis delay may be the underlying mechanism for the accumulation of eosinophil.Our published papers indicated that TLR9 signal pathway may be involed in the pathogenesis of asthma，but the molecular mechanism of eosinophil apoptosis delay regulated by TLR9 has not been fully understood。Our hypothesis is that TLR9-MyD88-PI3K-Akt-NF-κB may be involved in pathogenesis of asthma by regulation of eosinophil apoptosis delay mediated by inflammtory factors expression. We will analyse the relationship between the change of protein expression in the TLR9-MyD88-PI3K-Akt-NF-κB pathway and the eosinophil apoptosis delay、the characteristic of asthma;using TLR9 knockout mice for the asthma model to determine the role of this signaling pathway involved in the regulation of eosinophil apoptosis delay in the pathogenesis of asthma; using the in vitro cultured eosinophil, intervent key proteins in TLR9-MyD88-PI3K-Akt-NF-κB signal pathway,unclose the molecular mechanism of TLR9 pathway in the regulation of eosinophil apoptosis delay.Hoping to raise a new signal pathway in the pathogenesis of asthma and provide new therapeutic target.

嗜酸粒细胞气道聚集是支气管哮喘的主要特征，凋亡延迟可能是其气道聚集的潜在机制。本课题组已发表论文显示TLR9信号通路与哮喘发病间有联系，但是TLR9调控嗜酸粒细胞凋亡延迟的分子机制尚不清楚。本课题组推测：TLR9-MyD88-PI3K-Akt-NF-κB轴调控细胞因子表达介导嗜酸粒细胞凋亡延迟参与哮喘发病。为验证该假设，我们将使用流式细胞仪分离哮喘患者支气管肺泡灌洗液中嗜酸粒细胞，分析TLR9信号通路相关蛋白的改变与嗜酸粒细胞凋亡延迟及哮喘发病临床特征间的相关关系；采用TLR9基因敲除小鼠诱导哮喘模型，确定TLR9蛋白的缺失与嗜酸粒细胞凋亡延迟及哮喘发作的因果关系；体外培养分离的嗜酸粒细胞，靶向干预TLR9通路相关蛋白，揭示TLR9信号通路调控细胞因子表达介导嗜酸粒细胞凋亡延迟的分子机制。期望提出关于哮喘发病的新通路，为哮喘的药物治疗提供新靶点。

TLR9信号通路靶点干预在哮喘治疗上的应用是近年来的研究热点。本项目以TLR9基因缺失小鼠为研究对象，以信号通路关键蛋白干预为主要手段。发现：① 哮喘组小鼠肺组织TLR9蛋白表达显著升高，同时伴随JNK磷酸化水平升高。JNK抑制剂SP600125可以显著抑制肺组织中TLR9蛋白表达及肺部炎症（包括炎性细胞侵入，粘液分泌，杯状细胞增生），因此JNK-TLR9信号通路可能介导了哮喘发病。② 进一步研究证实TLR9基因缺失可以显著改善OVA诱导的气道炎症，抑制OVA诱导的HIOMT表达减少及BALF和血清中褪黑素水平的降低。同样，JNK抑制剂SP600125通过恢复HIOMT表达及BALF、血清中褪黑素水平缓解OVA诱导的C57小鼠气道炎症，但这种作用在TLR9缺失小鼠不再进一步增强。因此，JNK-TLR9信号通路通过抑制褪黑素的合成介导了OVA诱导的气道炎症。③ 另外，我们发现TLR9基因缺失可以显著抑制OVA诱导的抗凋亡蛋白Bcl-2表达及NLRP3炎症小体活化。且TLR9基因缺失显著降低OVA诱导的IL-1β、IL-18、IL-5和GM-CSF水平，IL-5和GM-CSF是促进嗜酸粒细胞存活的重要因子。因此，TLR9介导的抗凋亡信号激活及NLRP3炎症小体活化也在OVA诱导的气道炎症中有重要作用。④ TLR9配体CpG预处理可以显著恢复HIOMT表达及BALF、血清中褪黑素水平，同时抑制OVA诱导的气道炎症、抗凋亡蛋白Bcl-2表达及NLRP3炎症小体的活化。因此，CpG可能通过调节褪黑素合成影响凋亡/抗凋亡信号平衡及NLRP3炎症小体活化。⑤我们在细胞水平发现CpG-ODN预处理可以显著增强金葡菌诱导的RAW264.7和TLR9+/+原代小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬和自噬；靶向抑制JNK或p38磷酸化， RAW264.7和TLR9+/+原代小鼠腹腔巨噬细胞吞噬和自噬水平显著减低，然而他们并不能进一步降低TLR9-/-巨噬细胞的吞噬和自噬水平，可见CpG通过TLR9-JNK/p38信号通路促进金葡菌诱导的吞噬-自噬过程。总之，本项目为哮喘的非可控性炎症发病提供了一定的理论基础，为哮喘的治疗提供了潜在的新靶点。