SFTS 布尼亚病毒转录调控元件的鉴定及功能研究

The newly discovered zoonotic disease, severe fever with thrombocytopenia syndrome (SFTS) caused by a novel phlebovirus SFTS bunyavirus (SFTSV), was identified since 2009 in multiple provinces in China. To date, according to the surveillance data from China CDC, approximately more than 3000 SFTS cases have been reported in China, and the case fatality rate still remain to average12%. SFTSV (Phlebovirus, Bunyaviridae) possesses a genome composed of three negative-stranded RNA molecules. Each segment contains 3′ and 5′ noncoding regions with terminal complementary sequences and the transcription-replication of the L, M and S segments is regulated. To data, we know little about mechanism of the regulation. We have established SFTSV minigenomes system. The SFTSV minigenomes contained the luciferase reporter gene in antisense (virus RNA) orientation fanked by the noncoding regions of SFTSV RNA segment. The luciferase signals could be detected in cells after transfection, indicating the successful encapsidation, transcription and replication of the pol I-derived SFTSV minigenomes. Furthermore, recombinant Infectious SFTSV was generated by co-transfecting plasmids that contain the antigenomic RNA segments of SFTSV under the control of the pol I promoter with SFTSV NP and L protein expression vector into 293T cells. The recovered viruses were indistinguishable from the parental virus in terms of plaque morphology, growth kinetics, RNA accumulation, and protein expression. These data implied that the recombinant viruses replicated with near-wild-type efficiency in tissue culture cells. In this application, we propose to characterize the viral cis-elements (promoter location and structure, packaging signals, transcription termination signals) and investigate the role of the trans-acting factors (viral nonstructural protein NSs) in regulation process using established reverse genetic system, This study should provide critical insights into the mechanisms of transcription-replication regulation of SFTSV and may provide us with critical information regarding the design of effective intervention strategies.

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒（SFTSV），是我国新发病毒，可致人类严重发热伴血小板综合征（SFTS）。SFTS缺乏有效治疗手段，病人病死率较高，是我国公共卫生面临的严重威胁。SFTSV属布尼亚病毒科白蛉病毒属，为分节段负链RNA病毒，其基因组由S、M、L三个片段组成。SFTSV通过其基因调控元件调节自身基因的转录复制，但机制不详。目前，我们建立了SFTSV反向遗传学系统，成功拯救了带有报告基因的SFTSV微复制子和重组病毒，重组SFTSV与其亲本病毒在生物学特性上并无差异。本课题拟进一步利用此系统，对L/M/S片断非编码区进行各种修饰或改造，通过拯救病毒和微复制子的表型变化研究SFTSV启动子、包装信号的结构和功能以及可能的病毒反式作用因子NSs蛋白在SFTSV转录复制过程中的作用。此课题将推进SFTSV乃至布尼亚病毒分子病毒学的研究，并且为SFTS的防治提供理论基础和技术支持。

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒（SFTSV），是我国新发的布尼亚病毒科(Bunyaviridae)白蛉病毒属(Phlebovirus)病毒，可致人类严重发热伴血小板综合征（SFTS），入院病人病死率较高（12-30%），且缺乏有效治疗手段。至今，美国、日本、韩国已有类似病例报道。SFTSV可能广泛存在于东亚及北美，并有可能成为我国严重的公共卫生问题。本课题首先研究了发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）、西西里病毒(SFSV)、乌库病毒(UUKV) NSs蛋白抑制β干扰素产生的机制，发现白蛉病毒属病毒NSs蛋白均不同程度的抑制β干扰素启动子激活，且NSs蛋白通过泛素依赖的蛋白酶体途径降解维甲酸诱导基因-I（Retinoic acid induced gene I，RIG-I），来阻断下游信号通路的激活，从而抑制β干扰素的产生。在此基础上，我们意SFTSV为模型，深入探讨其抑制β干扰素产生以及与宿主因子相互作用的分子机制，详细分析了SFTSV NSs蛋白抑制β干扰素启动子激活的关键结构域：SFTSV NSs蛋白的N末端在抑制β干扰素启动子激活过程中有重要的作用；C末端为特异性结合TBK1的关键活性域，影响胞浆包涵体（inclusion bodies，IBs）的形成；N末端功能域特异性地介导RIG-I的降解在抑制干扰素产生过程中具有重要的作用。本研究首次发现了SFTSV NSs蛋白特异性与TBK1结合，形成IBs，抑制β干扰素的表达之外的一种新机制。进而提出并证实，SFTSV通过IBs依赖和IBs非依赖的两种方式抑制宿主β干扰素的表达。此发现不仅扩展了对于SFTSV逃逸宿主天然免疫的认识，而且SFTSV NSs蛋白关键功能域的鉴定为深入了解该病毒的致病机制奠定基础，为治疗该类疾病提供理论指导。白蛉病毒属病毒的其它病毒，如托斯卡纳病毒（TOSV）也通过NSs蛋白介导的泛素蛋白酶体依赖的途径降解RIG-I，逃逸宿主天然免疫的攻击，该机制可能为白蛉病毒属病毒所广泛采用的逃逸宿主天然免疫机制。这一共同机制的发现，为研究广谱抗白蛉病毒属病毒药物提供新的思路。我们还通过蛋白质组学方法和转录组研究SFTSV与宿主相互作用，并以我们上述提出的理论为指导，研究并发现抗SFTSV候选药物，并对其抗病毒机制进行了探讨。