PID1对猪肌内脂肪沉积的影响及其机理研究

At present, the PID1 gene studies mainly focus on humans and rats and there are few researches about porcine PID1 gene. Although porcine PID1 has been found to be correlated with porcine intramuscular fat deposition, the effects of PID1 on porcine intramuscular fat deposition and its underlying mechanisms are not clear. Based on this, in this project we will clone the porcine PID1 gene, construct the eukaryotic expression vector, prepare the recombinant porcine PID1 protein, and isolate and identificate the porcine intramuscular preadipocyte. On this basis, further in vivo studies will be performed to investigate the effects of active immunization against recombinant PID1 protein on the content of intramuscular fat, and in vitro studies will be conducted to examine the effects of porcine PID1 on porcine intramuscular preadipocyte proliferation and differentiation and the expressions of PPARγ, HSL, C/EBPα and FAS at mRNA and protein levels. The present project is of importance not only to provide theoretical evidence for improving the meat quality, but also to establish important molecular basis for revealing the mechanisms of intramuscular fat deposition.

目前对PID1基因的研究主要以人和鼠为对象，对猪PID1基因的研究较少。猪PID1被发现与猪肌内脂肪沉积存在关联性，但其对猪肌内脂肪沉积的影响及其作用机制尚不清楚。基于此，本项目在克隆猪PID1基因、构建真核表达载体、制备重组猪PID1蛋白和分离鉴定猪肌内前体脂肪细胞的基础上，进一步通过动物饲养试验研究重组猪PID1蛋白主动免疫猪后对猪肌内脂肪含量的影响，并采用体外细胞培养实验研究过表达猪PID1对猪肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响，同时检测PPARγ、HSL、C/EBPα、FAS基因mRNA 和蛋白水平表达的变化，以探讨PID1对猪肌内脂肪沉积的影响并初步揭示其作用机理。完成本研究，不仅可为肉品质的改善提供理论依据，还可为进一步揭示猪肌内脂肪沉积的机理奠定了重要的分子基础。

本项目成功克隆了猪PID1（pPID1）基因，构建了原核表达载体pET-28a(+)-pPID1和毕赤酵母表达载体pPICZαA-pPID1，实现了其在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达，质谱和Western blot结果表明，表达产物为重组猪PID1蛋白。纯化后的重组蛋白经变性复性处理，发现其能促进3T3-L1前体脂肪细胞的增殖，从而表明其具有生物学活性。将纯化后的重组蛋白多次免疫SD大鼠，成功制备了猪PID1多克隆抗体，ELISA结果表明，制备的多克隆抗体效价达1:20480，Western blot结果显示，该多克隆抗体能够特异性识别重组猪PID1蛋白。用制备的多克隆抗体检测了PID1蛋白在DLY猪不同组织中的表达规律，结果表明，PID1蛋白主要表达于猪肌肉组织和肝脏中。为体内体外过表达猪PID1，我们构建了重组质粒pcDNA3.1(+)-pPID1。动物试验上的结果表明，肌肉注射重组质粒pcDNA3.1(+)-pPID1显著上调了小鼠腓肠肌中PPARγ蛋白的表达，重组猪PID1蛋白主动免疫则显著下调了小鼠腓肠肌中PPARγ蛋白的表达。采用酶解和差数贴壁法从3日龄DLY猪背最长肌中分离出肌内前体脂肪细胞，免疫荧光和油红O染色结果表明，所分离的细胞为肌内前体脂肪细胞（约100% Pref-1阳性）且能分化为成熟脂肪细胞。体外细胞实验结果表明，转染pcDNA3.1(+)-pPID1和添加重组猪PID1蛋白均促进了猪肌内前体脂肪细胞的增殖。另外，转染pcDNA3.1(+)-pPID1以及添加重组猪PID1蛋白于细胞并诱导其分化，实时荧光定量PCR和Western blot结果显示脂肪细胞分化转录因子PPARγ、C/EBPα的mRNA水平和蛋白水平显著上调，实时荧光定量PCR结果显示脂肪细胞分化早期标志基因脂蛋白脂酶（LPL）的mRNA水平显著上调，油红O染色和甘油三酯分析结果表明脂滴形成增加。综上结果表明，pPID1促进了猪肌内前体脂肪细胞的增殖和分化并在肌内脂肪沉积中发挥着重要的作用。项目研究结果为肉品质的改善提供了理论依据，同时为进一步揭示猪肌内脂肪沉积的机理奠定了重要的分子基础。