5HRE与CEAp联合调控抑癌基因RASSF1A系统治疗CEA阳性肿瘤的基础研究

消化道恶性肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病，针对恶性肿瘤的基因治疗越来越受到重视。本研究在课题组已有研究的基础上，利用人VEGF基因5'-端缺氧反应元件（HRE），与癌胚抗原启动子（CEAp）基因重组，构建缺氧可诱导的CEA阳性肿瘤特异性的基因转录调控元件，用该元件调控抑癌基因RASSF1A的表达，并以逆转录病毒载体pLEGFP作为工程载体，构建成能将抑癌基因RASSF1A在CEA阳性肿瘤细胞内表达的逆转录病毒表达载体，进一步在体内外观察该治疗系统的抗肿瘤活性。本基因治疗载体具有较高的靶向性与特异性，能高效的发挥抗肿瘤作用。本课题突破了传统的肿瘤瘤苗研究思路，结合了肿瘤缺氧微环境、CEA启动子调控与抑癌基因抗肿瘤研究的成果，在基因转录水平靶向性地调控抑癌基因RASSF1A的表达，符合肿瘤疫苗设计的基本要求，为治疗CEA阳性肿瘤探索新的途径。

胃癌是消化系常见的恶性肿瘤，严重威胁人类的健康，基因治疗是充满希望的治疗胃癌有效手段。本课题研究重组慢病毒介导的抑癌基因RASSF1 A载体LV-5HRE-CEAp-RASSF1A在体外、体内对低氧条件下CEA阳性的人胃癌细胞株SGC7901的抑制作用。为胃癌的基因治疗探索新的方法。通过qRT-PCR法、细胞免疫组织化学方法(SP)及Western blot法检测细胞CEA及RASSF1A表达水平，从而筛选出实验组细胞及阴性对照细胞；通过分子克隆技术构建慢病毒表达载体LV-5HRE-CEAp-RASSF1A，双萤光素酶报告基因载体，采用双萤光素酶报告基因载体实验及体外调控RASSF1A表达实验检测调控序列5HRE-CEAp的靶向性；通过体内及体外实验检测LV-5HRE-CEAp-RASSF1A对胃癌细胞的抑制作用；通过Western blot法探索其抑制SGC7901的分子机制。结果表明：1）成功构建低氧诱导的靶向CEA转录阳性肿瘤的慢病毒载体LV-5HRE-CEAp- RASSF1A；2）双萤光素酶报告基因载体实验及体外调控RASSF1A表达实验证实5HRE-CEAp具有靶向低氧及CEA转录阳性胃癌细胞的双靶向特异性；3）体外实验表明慢病毒载体LV-5HRE-CEAp-RASSF1A低氧环境中通过抑制细胞增殖生长、促进凋亡、抑制细胞周期停止在G1期、抑制细胞克隆形成、抑制细胞侵袭转移等多个方面来抑制CEA转录阳性胃癌细胞SGC7901的恶性表型；4）体内实验表明慢病毒载体LV-5HRE-CEAp-RASSF1A能够能够在裸鼠胃癌移植瘤中长期表达RASSF1A并抑制裸鼠胃癌移植瘤的生长；5）慢病毒载体LV-5HRE-CEAp-RASSF1A抑制胃癌细胞的机制可能为低氧环境下在CEA转录阳性胃癌细胞中高表达RASSF1A蛋白，进而促进Caspase3蛋白表达，进而促进凋亡；抑制MMP2蛋白表达，进而抑制肿瘤细胞的侵袭转移；抑制CyclinD1蛋白的表达，进而减慢细胞周期。本研究构建的慢病毒载体在体内体外实验中初步展现了低氧诱导及靶向CEA转录阳性胃癌细胞的特点。为LV-5HRE-CEAp-RASSF1A临床应用奠定实验基础。