基于反向代谢工程的红酵母类胡萝卜素代谢调控分子机制研究

Microorganism hold great potential to produce natural carotenoids, however, relatively little is known about the regulation molecular mechanisms of its key genes. Based on the completion of Rhodotorula glutinis genome sequence and the establishment of its transformation system, this project intends to explore these key genes through a "from phenotype to genotype" strategies by inverse metabolic engineering. Firstly, a mutant library is constructed by Agrobacterium-mediated transformation, then strains with specific colors is picked out and subjected to genome walking to find out the flanking sequence of T-DNA. By bioinformatics analysis, key genes of carotenoids biosynthetic regulation are identified. After that, molecular biology technologies such as EMSA, gene overexpression, gene knockout, RT-qPCR are used to analyze the genes’ function and regulation mechanism. Finally, a carotenoids regulatory networks consisted of these key genes is drawn to provide target information for carotenoid biosynthetic regulation in red yeast. The result is going to lay the theoretical foundation for the comprehension and application of carotenoid biosynthetic engineering and regulatory mechanisms. The project will promote the development of microbial carotenoids industrial and give prosperity to the modern food industry.

微生物法生产天然类胡萝卜素潜力巨大，然而其代谢调控的关键基因及调控分子机制尚不明晰。本项目拟基于粘红酵母基因组测序的完成和遗传操作系统成功构建的工作基础，首先，采用反向代谢工程策略，以"从表型到基因型"的研究思路，利用非靶向基因组编辑技术，获得具有特异颜色表型的突变菌株，结合染色体步移及生物信息学手段，确定类胡萝卜素代谢调控的关键基因；其次，利用凝胶迁移率试验、基因过表达、基因敲除、RT-qPCR等分子生物学手段，解析关键基因的功能及调控分子机制；最终，绘制由这些基因构成的类胡萝卜素代谢调控网络。本项目将为红酵母类胡萝卜素生物合成途径的调控及产量的增加提供靶点信息，为调控机制的解析和应用奠定理论基础。项目成果将推动基于微生物的类胡萝卜素产业发展，为现代食品工业注入新活力。

微生物法生产天然类胡萝卜素潜力巨大。圆红冬孢酵母是一株性状优良的产类胡萝卜素酵母，然而单位菌体类胡萝卜素含量较低，其代谢调控的关键基因及调控分子机制尚不明晰,是制约其工业生产瓶颈。针对该问题，本项目采用反向代谢工程策略，以"从表型到基因型"的研究思路，围绕以下几方面内容展开研究：一、利用农杆菌介导的非靶向基因组编辑技术，以外源T-DNA片段对红酵母进行基因突变，首先对转化条件进行了优化，提高了转化效率，比文献报道提高了2.4倍，采用优化后方法构建了突变文库，并从突变文库中筛选出17株颜色各异的突变菌株；二、采用HPLC-MS对类胡萝卜素种类和含量进行分析。其中，A1-15类胡萝卜素总量是野生型的 9.3倍， 其红酵母红素的产量高达25.1 mg/L DCW， 占总量96.6%；三、采用染色体步移术对突变菌株的插入位点进行分析，利用RT-PCR技术对类胡萝卜素代谢途径上的关键基因进行分析，结合文献调研阐明突变对类胡萝卜素代谢途径代谢产生影响的机制；四、对高选择性生产红酵母红素的A1-15进行培养基优化，采用单因素和响应面方法，使得最终红酵母红素产量可达21.3 mg/L,占总类胡萝卜素的94%，时间缩短为原先的1/3；五、进一步将优化后的转化方法其他非常规酵母——斯达氏油脂酵母中，首次成功实现农杆菌介导转化斯达氏油脂酵母，利用该方法评价了两个外源的强度，为今后斯达氏油脂酵母中外源基因的表达提供了有利的工具。综上，本项目对于红酵母类胡萝卜素生物合成途径的调控及产量的增加提供靶点信息，为调控机制的解析和应用奠定理论基础。此外，还证明了本项目提出的反向代谢工程的策略可应用于其他非常规酵母代谢通路的研究中，具有较广泛的普适性。