利用反向代谢工程技术识别酿酒酵母抗氧化胁迫关键基因

在酿酒酵母主导的工业生产过程中，普遍存在氧化胁迫问题，酿酒酵母感知氧化胁迫并清除活性氧的能力对于菌株发酵活性的保持有重要意义。本项目将反向代谢工程技术应用到酿酒酵母氧化胁迫应答的研究中，采用"从表型到基因型"的全新研究思路，结合反转录工程（gTME）和基因表达系列分析(SAGE)技术，直接对酿酒酵母抗氧化胁迫关键基因进行识别，并进行功能验证和分析。本研究的成果将有助于揭示酿酒酵母氧化胁迫应答的分子机制，并且为酿酒酵母抗氧化胁迫定向基因改良技术平台的建立提供理论依据。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是重要的工业微生物，作为发酵剂被广泛的应用于酒类酿造、面食发酵、燃料乙醇生产、膳食补充剂和药物活性成分生产等众多工业领域。酿酒酵母自身的特性决定着发酵的进程和产品的质量。在酿酒酵母主导的工业生产过程中，普遍存在氧化胁迫问题，酿酒酵母感知氧化胁迫并清除活性氧的能力对于菌株发酵活性的保持有重要意义。本课题采用全转录工程技术（global transcription machinery engineering，gTME），随机突变酿酒酵母RNA 聚合酶通用转录因子Spt15和Taf25并分别构建突变文库，将突变基因在酿酒酵母中克隆表达，通过双氧水耐受性试验筛选抗氧化表型突变株，最终筛选出两株表现最为优良的突变株spt15-5和taf25-3。在氧化胁迫下，这两株突变株的抗氧化能力显著提高，胞内活性氧浓度明显低于原始菌株。综合各项指标，taf25-3的抗氧化能力和发酵能力较spt15-5更强，因此，对taf25-3开展了基于RNA-Seq的转录组学研究，以发现在氧化应答方面起作用的关键基因。对比原始菌株，在氧化胁迫条件下，共有1006个基因表达水平出现了显著的差异。在这些基因中，共确定了15个转录因子编码基因，大多数在2 mM 双氧水胁迫下出现了上调。基于GO和KEGG代谢通路富集分析，这些基因参与了多种代谢途径。其中与MAP激酶和cAMP依赖的蛋白激酶A（PKA）信号转导通路相关的基因也表现出了显著的表达量增加。以上结果说明MAPK途径和PKA途径可能涉及到酵母细胞应答氧化胁迫，尤其是MAPK途径，它可能通过对通用转录因子Taf25的突变而得到修饰。通过本课题的研究，验证了全转录工程技术提高酿酒酵母氧化耐受能力的可行性，并通过转录组学研究确定了酿酒酵母细胞在应答氧化胁迫时的关键基因和代谢途径，研究结果丰富了对酿酒酵母氧化胁迫应答机制的认识，能够为工业菌株的定向改造提供必要的理论依据。