β-内酰胺酰化酶底物在酶催化过程中的运动轨迹

生物大分子的构象变化，特别是从基态到过渡态的变化，是酶催化反应所必需的一个重要组成部分。本项目拟通过研究β-内酰胺酰化酶分子中发生的三种完全不同类型的酶催化反应，包括，正常底物分子的水解、酶分子的亲和标记和头孢菌素酰化酶前体及中间体的自身剪切动力学，并结合已有的晶体学数据来描述底物/配体分子在酰化酶中的运动轨迹，从而揭示酶在催化反应中的动态过程。现有结果表明,头孢菌素酰化酶的底物类似物BA-7ACA能够特异性地标记在该酶分子中的TrpB4上，而TrpB4却处于一个紧密堆积的三明治结构的中心。这意味着在酶催化过程中，酶分子必须有一个很大的构象变化，形成一个贯穿于整个酶分子的底物通道。这一动态分子模型的建立将为包括青霉素酰化酶（PA）和头孢菌素酰化酶(CA)在内的Ntn超级家族的酶学研究和分子改造提供新的思路。

生物大分子的构象变化，是酶催化反应所必需的一个重要组成部分。头孢菌素酰化酶（CA）和青霉素G酰化酶（PGA）可用于生产重要的制药中间体，具有很高的应用价值。研究β-内酰胺酰化酶分子中发生的三种完全不同类型的酶催化反应之间的相互关系，包括，1）底物的水解、2）亲和标记和3)头孢菌素酰化酶自身剪切中间体的进一步剪切，并结合晶体学数据则有可能揭示酶在催化反应中的动态过程。.溴乙酰-7ACA（BA-7ACA）能够亲和标记这类酰化酶，通过LC-MS检测，发现其标记机理在于SerB1的羟基上发生了烷基化反应。这一发现纠正了以前文献报道中的错误。有趣的是，对于PGA，BA-7ACA具有双重特性，一方面它能被PGA水解，另一方面它能通过亲和标记抑制酶的活性。这预示着底物/配体在酶催化中心的结合是一个动态过程。.长期以来，对于CA的第二步自剪切机制一直存在着很大争议，主要原因在于对该酶的动态机制缺乏认识。首先，通过高分辨质谱我们确定了CA前体中的空间肽是由GDPPDLADQG组成的10肽，并证实了CA -亚基的C端是Glu169。它对于CA的第二步自剪切具有高度的专一性。将Glu169移动到空间肽的任何位置，第二步自剪切都发生在它的C端，这与酶的水解功能具有很高的相似性。这些结果阐明了CA的第二步自剪切是的分子内相互作用，由N-端亲和基团催化完成。这一新催化模型的提出预示该酶必须经历一个很大的构象变化，以克服距离约22埃的空间障碍。这一发现为酶催化的动态机制提供了重要的实验证据。.研究还发现空间肽被缩短的CA突变株仍然可以发生自剪切。因此我们对三个具有代表意义的突变株进行了晶体学研究。与野生型结构比较，突变蛋白结构变化主要发生在-亚基C端。经计算发现，突变后的晶体结构存在较大的势能变化，足以克服水解反应和第二步自剪切反应的活化能能垒，说明了酶的构象变化对催化反应有重要贡献。.环噻唑霉素生物合成途径的研究则是在课题调整过程中的另一亮点。环噻唑霉素属于硫肽类抗生素，经由核糖体合成后再由一系列的酶参与后修饰，形成一系列的异常氨基酸衍生结构，最后成环切割分泌到胞外。我们成功克隆了环噻唑霉素合成基因簇，并实现了在变铅青链霉菌中的异源表达。根据生物信息学分析我们推导了环噻唑霉素生物合成途径。随后利用点突变环噻唑霉素前体肽的方法，获得了一系列环噻唑霉素衍生物。