EPAS1基因突变通过Notch信号通路促进嗜铬细胞增殖与迁移的作用和机制研究

Gene mutations are the major molecular events that drive the development and progression of pheochromocytomas. The total mutation rate (germline + somatic)was as high as 70%. In our previous work, whole exome sequencing of 89 samples showed that the mutation rate of the somatic EPAS1 gene was as high as 8%, metastasis rate was nearly 30%, and the recurrence rate was 100%. Functional experiments confirmed that mutations affect VHL-mediated proline hydroxylase degradation of HIF-2α pathway, leading to accumulation of HIF-2α. Significant HIF-2α accumulation, cell proliferation and migration were observed by transfection of the EPAS1 mutant plasmid into the chromaffin cell line. TCGA biological analysis and sample validation suggest that the Notch signaling pathway may play an important role. This project aims to answer the following scientific questions: 1. The biological effects of the EPAS1 gene mutation-HIF-2α-Notch signal axis. 2. The potential molecular mechanism of HIF-2α-Notch signaling pathway in pheochromocytomas. 3. The clinical significance of EPAS1 gene mutation-HIF-2α-Notch signal axis for early diagnosis, individualized prevention and treatment of malignant tumors. The research results will help us to further understand the molecular mechanism of recurrence and metastasis of pheochromocytomas，which will provide a scientific basis for molecular targeted therapy.

基因突变是驱动嗜铬细胞瘤发生、进展的主要分子事件。研究发现嗜铬总突变率（胚系+体细胞）高达70%。前期工作中，我们对89例患者全外显子测序发现体细胞EPAS1基因突变率高达8%，携带者转移率近30%，复发率100%。功能实验证实，突变影响VHL介导的脯氨酸羟化酶降解HIF-2α途径致HIF-2α累积。转染EPAS1突变质粒至嗜铬细胞系观察到显著的HIF-2α累积及细胞增殖、迁移。TCGA生信分析及样品验证提示Notch信号通路可能在其中发挥重要作用。在前期研究基础上，本课题拟解答：1、EPAS1基因突变-HIF-2α-Notch信号轴促进嗜铬细胞增殖、迁移的生物学作用。2、突变造成HIF-2α累积调控Notch通路的具体分子机制。3、EPAS1基因突变-HIF-2α-Notch信号轴对恶性嗜铬早期诊断、个体化防治的临床意义。课题将从新角度阐述嗜铬转移机制，为靶向治疗提供新思路。

嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（以下统称为嗜铬细胞瘤）分别位于肾上腺髓质和副神经节，可分泌儿茶酚胺，引起头痛、心悸、出汗，阵发性高血压等典型临床症状，多数患者通过术前儿茶酚胺激素评估明确诊断，手术切除肿瘤能得到临床治愈。然而，约10%-15%的肿瘤会在术后数月至数年发生远隔转移，即为转移性嗜铬细胞瘤，与其他肿瘤不同，恶性嗜铬细胞瘤很难通过病理直接诊断，只有在患者发现转移灶时才能明确。这为临床诊治恶性嗜铬细胞瘤造成了很大挑战，基于嗜铬细胞瘤普遍存在的恶性潜能，2017年WHO最新的定义中，取消了良性分类，并建议对所有术后嗜铬细胞瘤患者进行长期跟踪随访，本研究通过建立的患者队列，主要成果如下：.1）建立嗜铬细胞瘤诊断评估体系：a.激素评估体系：对儿茶酚胺激素合成通路共12种合成终产物与中间代谢产物进行全面质谱检测。b.功能影像评估体系: 通过间碘苄胍(MIBG)、68Ga-DOTATATE标记的PET-CT进行特殊位置肿瘤的功能定位诊断。c.代谢评估体系：采用人体生存模拟舱-代谢舱，采集嗜铬细胞瘤患者全面数据。评估患者术前术后动态变化。d.建立肾上腺疾病登记项目，扩大和完善嗜铬细胞瘤病例库。.2）建立了嗜铬细胞瘤转移预测体系：a.循环分子标记物检测：对嗜铬细胞瘤循环肿瘤细胞进行计数。统计分析循环肿瘤细胞计数与患者肿瘤分期、分型、疾病进展与预后之间的关系，探讨肿瘤细胞计数结果的临床意义与价值。b.结合SDHB胚系基因突变、原发肿瘤ERBB-2蛋白高表达，原发肿瘤直径、位置，血管侵犯以及儿茶酚胺分泌类型建立的嗜铬细胞瘤转移预测系统，与单独使用临床危险因素显示出更优异的预测准确性。.3）嗜铬细胞瘤EPAS1突变类型异质性及功能探究，发现EPAS1突变是主克隆突变，描绘EPAS1突变型嗜铬细胞瘤进化类型。同时揭示EPAS1基因突变通过Notch信号通路激活，导致HIF-2α累积，促进细胞增殖、迁移。.本研究从临床诊断、转移预测、分子机制三个方面完善了嗜铬细胞瘤诊断体系和分子机制，对临床具有重要指导和应用价值。