钝齿棒杆菌FarR蛋白对精氨酸生物合成网络的调控机制及其与ArgR的关系研究

The FarR protein was comfirmed to be involved in the regulation of arginine biosynthesis in corynebacterium. However, the regulatory mechanism of FarR has never been reported. Our preliminary research showed that FarR exhibited significant difference in regulation of the related gene transcription in arginine biosynthetic pathway when the negative regulator ArgR was expressed or deleted in C. crenatum. Thus, FarR and ArgR were inferred to be involved together in the regulation of arginine biosynthetic pathway in C. crenatum. In this proposal, C. crenatum strains of AS 1.542, AS 1.542 ΔargR, AS 1.542 ΔfarR and AS 1.542 ΔargRΔfarR will be used as models. RNA-seq method, based on the high-throughput sequencing, will be employed to obtain the differrential expression genes of transcriptome of the four strains mentioned above. Bioiformatics methods will be used to analyze the related genes of arginine biosynthetic network and locate the regulatory regions in the upstream of those related genes on the genome. The regulatory regions that can bind with FarR or ArgR will be investigated by employing chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique, and then the competitive relationship and precise positions on DNA that interact with both of the regulatory proteins of FarR and ArgR will be further analyzed by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). In conclusion, comprehensive and systematic analysis of the molecular regulation mechanism of FarR in arginine biosynthetic network of C. crenatum and its relationship with ArgR will be obtained with the proposed methods.

在棒杆菌Arg生物合成中，FarR参与其合成调控，但目前其调控机制不明。申请者前期实验发现Arg合成途径的负调控因子ArgR表达或缺失时，FarR对钝齿棒杆菌Arg合成途径的相关基因调控作用差异显著，因此推测FarR与ArgR在调控Arg合成上存在关联性。本项目拟以野生钝齿棒杆菌AS 1.542、AS 1.542ΔargR、AS 1.542ΔfarR及AS 1.542ΔargRΔfarR四株菌为模型，采用RNA-seq方法获取两种调控蛋白共表达、独立表达及共缺失条件下的转录组差异表达基因；采用生物信息学手段分析与Arg生物合成网络相关的基因并定位其上游调控DNA序列；采用ChIP技术明确FarR与ArgR能结合的调控DNA序列；采用EMSA分析二者在均能结合的调控DNA序列上占据的精确位置及二者的竞争关系。旨在系统解析FarR在钝齿棒杆菌Arg生物合成网络中的调控机制及其与ArgR的关系。

在棒杆菌Arg生物合成中，FarR参与其合成调控，但目前其调控机制不明。ArgR是精氨酸合成途径的负调控因子，因此研究FarR与ArgR在Arg合成上存在的关联性。.1.farR、argR 转录效率与菌体生长阶段相关性的研究。RT-qPCR 分析野菌株、C. crenatum ΔfarR 及 C. crenatum ΔargR 三株菌在对数生长期的早期、中期、后期以及平稳期的初期、中期及后期等 6 个阶段 farR、argR 的转录水平，结果表明二者之间不存在明显的调控关系；farR基因的敲除对细胞的生长产生不利的影响，影响了细胞生长的稳定性。.2.将大肠杆菌中 lacR 的启动子置于 farR 基因的上游，通过无痕敲除技术将弱启动子取代了原来的启动子，使 farR弱表达并通过RT-qPCR 证实farR 基因的转录水平发生了下降。摇瓶发酵观察到精氨酸产量下降。说明FarR 对精氨酸合成途径的调控作用与韩国科研组在“Nature Communication”报道其为精氨酸负调控蛋白的结果不符。.3.敲除了依赖NAD+的赖氨酸脱乙酰酶编码基因cobB。发酵测精氨酸产量提高了11%；采用WB分析实验组和对照组的可溶性蛋白KAc水平，结果表明实验组的总体KAc水平较对照组高；将其中一条带进行HPLC/MS/MS分析，显示实验组获得了17个乙酰化修饰蛋白质，其中3个蛋白质在对照组中未检测到；11个蛋白质显示乙酰化水平获得了提高，其中有两个蛋白质是精氨酸合成途径的蛋白：ArgC和ArgF。.4.ClpB常和DnaK一起行使相关功能。因此构建dnaK/clpB敲除菌株及其互补菌株研究ClpB的功能。结果表明dnaK/clpB在pH应激和乙醇应激是不必要的，在热应激中dnaK缺陷菌株和clpB缺陷菌株显示出生长速率降低，发酵过程中ClpB基因的缺失影响葡萄糖消耗和L-精氨酸、L-谷氨酸，乳酸的产生。.5.ClpX和ClpP参与包括应激反应和能量代谢等。大多数微生物都有单一的clpP基因， 而钝齿棒杆菌含有两个clpP同源基因。 本研究中克隆了clpX、clpP1和clpP2， 并表达和表征其融合蛋白。构建了clpX缺失突变体和互补菌株，结果表明ClpX在热应激、pH应激和乙醇应激中起着重要的作用且参与了发酵过程中NADPH的合成和葡萄糖消耗。.以上结果可指导提高L-Arg产量。