钝齿棒杆菌精氨酸生物合成途径中argR基因调控机制的研究

钝齿棒杆菌(C. crenatum)在国内氨基酸生产中被广泛应用。该菌ArgR蛋白是其精氨酸生物合成途径中的一个调控蛋白。现有文献报道ArgR蛋白在原核生物中为负调控因子。但作者前期工作发现，含argR基因表达载体的C. crenatum 菌，其产精氨酸能力是原菌的2.5倍；而敲除了argR基因的C. crenatum菌，其精氨酸产量比原菌略有降低，且菌体生物学特征发生了改变。以上结果与已有文献报道的argR基因为负调控因子有所不同，且表明argR基因在钝齿棒杆菌细胞生命活动中可能具有多效性。基于以上前期实验结果，申请人拟通过蛋白质凝胶迁移率实验寻找钝齿棒杆菌ArgR蛋白与精氨酸生物合成途径中启动子/操作子区域特异性结合序列；同时采用荧光定量PCR方法，分析argR基因与精氨酸生物合成途径中主要合成酶基因在转录水平上的关系，旨在全面分析argR基因对钝齿棒杆菌精氨酸生物合成途径的调控机制。

本实验室筛选到了一株argR基因致死的高产精氨酸的菌株C. crenatum MT，通过构建回补菌，发酵试验发现精氨酸产量显著性下降（67.9%）；同时荧光定量PCR试验也反映精氨酸生物合成途径的相关基因argCJBDF-argG及carA的转录水平也发生了显著性下调，此结果证明ArgR蛋白在精氨酸生物合成途径中扮演着负调控的角色。同时，精氨酸的产量并没有下降为野生型水平，推测诱变菌中可能还发生了一些其他相关基因的突变，这些突变总体表现对精氨酸积累也是具有正效应。.另外，我们通过无痕敲除技术敲除了野生型钝齿棒杆菌AS 1.542的argR基因，结果显示argCJBDF-argG及carA在转录水平发生显著性上调，但筛选到的缺失株C. crenatum AS 1.542ΔargR未能观察到精氨酸产量与野生株相比有明显的差异。说明仅通过缺失负调控因子并不能改善精氨酸的产量，虽然精氨酸生物合成途径中相关基因的转录水平发生了上调。因此，本文所研究的C. crenatum要实现精氨酸产量上的突破， 除了要使负调控因子缺失外，还要在此基础上打开遏制精氨酸大量产生的其他瓶颈。.通过凝胶阻滞试验（EMSA）试验发现argC、argB、argG、argF及carAB的上游启动子序列均有结合反应，表明ArgR对精氨酸生物合成途径中的相关基因的调控是直接的。.我们采用氨基酸自动分析仪对野生菌AS 1.542 和诱变菌MT培养120小时的发酵液上清进行了分析，发现一种氨基酸：丙氨酸浓度在诱变菌中发生了显著性下降。丙氨酸是由谷氨酸脱胺至丙酮酸生成的，而丙酮酸是进入三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环的核心碳源，谷氨酸是由TCA循环的中间物α-酮戊二酸合成且是精氨酸的前体，即丙氨酸产量的降低可以降低丙酮酸和谷氨酸的消耗，因此分析突变株的丙氨酸生成浓度下降有利于精氨酸的积累。发现8种氨基酸的浓度显著性上升，这8种氨基酸分别是甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、脯氨酸、赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸，其中脯氨酸的前体物质是谷氨酸，赖氨酸的前提物质也是TCA循环的中间物草酰乙酸，因此阻断脯氨酸和赖氨酸的合成应是有利于精氨酸的积累。以上结果为后期本课题组对诱变菌进行全基因组测序并采用系统生物学来分析和改造菌种提供了指导。