Olig2/GFP(KI)hESCs来源的过表达Olig2/Nkx2.2的少突胶质祖细胞在脱髓鞘疾病治疗中的应用

Exhaustion of oligodendrocyte progenitor cells and oligodendrocyte differentiation fails are the main obstacle of remyelination. Several studies have reported that human embryonic stem cell (hESC)-derived oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can potentially promote remyelination after spinal cord injury. The key problem in this area is how to produce highly purified OPCs and induce OPCs to differentiate into maturational oligodendrocyte with high efficiency. To date, there is no report of hESC-derived OPCs transplantation into developmental white matter injury model and adult brain demyelinating animal model. In this study, we will targeted Olig2 , a basic helix-loop-helix transcription factor, in SNUhES1 line （Olig2-H1） by homologous recombination. Authentic OPCs can be efficiently isolated form Olig2-H1 using a fluorescence-activeted cell sorting (FACS) method combining two markers Olig2 and Nkx.2.2. Characteristics of OPCs transfected by Olig2 and Nkx.2.2 could be identified by immnunocytochemistry and Real-Time PCR Analysis and the physiological function could be analized by electrophysiological Analysis. The migration and differentiation of OPCs and remyelination would be observed by DGR neuron/OPCs and brain slices/OPCs culture and transplantation Olig2＋/Nkx.2.2+ OPCs into hypoxic-ischemia neonatal rat model and adult demyelination mouse model. This is the first to transplant OPCs with highly expressed Olig2/ Nkx.2.2 derived from Olig2-H1 into animal models brain of dymyelinating diseases. This work will facilitate the research on development biology and cell based therapy for dymyelinating diseases.

少突胶质祖细胞（OPCs）在病变部位聚集不足及分化失败是髓鞘再生的主要障碍。研究发现人胚胎干细胞（hESCs）来源的OPCs移植是治疗脱髓鞘疾病的一条有效途径；如何从hESCs获取高纯度的OPCs并促使其有效分化是有待解决的主要问题，且尚未见hESCs来源的OPCs移植治疗发育期脑白质损伤及成年脑脱髓鞘疾病的报道。本项目拟用同源重组技术构建Olig2-GFP载体敲入SNUhES1 （Olig2-H1），用流式细胞术结合特异标记物Nkx.2.2纯化由Olig2-H1分化的OPCs，用Olig2和Nkx.2.2共转染OPCs并对其特性及电生理功能进行鉴定；通过神经元/OPCs和脱髓鞘脑片/OPCs共培养及在体移植，观察 OPCs的迁移、分化及髓鞘再生作用。该项目首次用过表达Olig2/Nkx2.2的高纯度OPCs移植治疗脱髓鞘疾病，预期结果将为发育生物学及脱髓鞘疾病治疗研究提供依据。

少突胶质细胞是中枢神经系统（CNS）髓鞘形成细胞，多发性硬化、脑白质损伤及脊髓损伤等脱髓鞘疾病与少突胶质细胞损伤直接相关。脑内少突胶质前体细胞（OPCs）匮乏以及OPCs分化和成熟失败导致内源性髓鞘再生障碍，以干细胞为主的细胞代替策略成为脱髓鞘疾病治疗的主要途径之一。人胚胎干细胞（hESC）来源的OPCs移植可以促进脊髓损伤后的髓鞘再生，减轻继发性病变；但还不清楚hESC来源的OPCs移植是否能促进发育期脑白质损伤及成年脑脱髓鞘疾病的恢复；另外，如何从促使hESC来源的OPCs并其移植后能有效分化为成熟少突胶质细胞也是本研究的主要内容之一。.本项目分别建立了过表达Olig2的mESC（R1/E）和同时过表达Olig2/Nkx2.2的hESC (H9)，体外诱导ESC分化为OPCs并对其特性进行鉴定；OPCs体外扩增后通过与神经元或脱髓鞘脑片共培养观察其体外成髓鞘作用，通过在体移植观察其迁移、分化及髓鞘再生作用。结果表明ESC体外过表达Olig2或者Olig2/Nkx2.2不改变其多分化潜能特性，而且过表达Olig2/Nkx2.2可以加速ESC向OPCs分化。OPCs与脊髓组织来源的神经元共培养研究表明，Olig2/Nkx2.2可以促进ESC来源的OPCs分化，成熟少突胶质细胞与神经元轴突呈现包绕趋势；但OPCs与卵磷脂诱导的脱髓鞘小脑脑片共培养，没有发现明显脱髓鞘脑片髓鞘再生作用。OPCs移植到Cuprizone诱导的脱髓鞘模型小鼠胼胝体，免疫组织荧光染色及超微结构显示Olig2/Nkx2.2可以促进移植OPCs向少突胶质细胞分化以及髓鞘再生；但OPCs移植到缺血缺氧导致的脑白质损伤新生大鼠脑内，并未见明显的髓鞘生成。以上研究表明，过表达Olig2和Nkx2.2可以促进少突胶质细胞分化成熟，ESCs来源的OPCs具有包绕神经元形成髓鞘的功能以及促进Cuprizone诱导的成年脱髓鞘小鼠髓鞘再生的作用，但卵磷脂或缺血缺氧导致的炎性损伤微环境可能会抑制OPCs的存活分化及髓鞘再生。本研究为发育生物学及脱髓鞘疾病的治疗研究提供理论依据。在本项目的基础上，将进一步用人胚胎干细胞来源的OPCs与小分子化合物联合治疗早产儿脑白质损伤疾病，为临床应用提供实验依据。