Nrf2诱导自噬干扰BPD新生鼠肺上皮细胞DNA损伤修复及其机制研究

There is no doubt oxidative stress is involved in the pathology of bronchopulmonary dysplasia (BPD) in preterm infants, and it is even considered as the only way which participates in all the form of BPD development. However, it is not clear whether DNA damage takes part in the pathogenesis and development. Our early research has proved that DNA damage occurs throughout the whole process of the oxidative stress response. Based on that, we first propose epithelial cell repair disability is the initial step affecting BPD lung development. Taking the autophagy activation as the starting point, we elucidate that althouth the classic DNA repair pathway is activated by the 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1), but it is not enough to maintain the stability of lung epithelial cells in the early stage of BPD; we also verify the excessive activation of autophagy impairs the effect of OGG1 in the specific recognition and resection of 8-oxoG in the DNA chain, in consequence interferes with damaged DNA repair process in the early stage of BPD. The molecular mechanism of autophagy triggered by Nrf2/Keap1 Signaling Pathway and "shielding" of autophagy protein p62 is explored. Finally the protective effect of Nrf2 activation is confirmed in both vivo and vitro that it improves late lung development outcomes in BPD.

目前认为氧化应激反应几乎是所有支气管肺发育不良（BPD）早产儿发病的必经之路，然而DNA损伤作为氧化应激最严重的损伤形式，是否参与该病发生尚不清楚。本项目在前期发现并证实DNA损伤贯穿于氧化应激全程的基础上，率先提出了肺上皮细胞（AT-Ⅱ）DNA修复障碍是影响BPD肺泡发育的最早期环节。首先建立BPD动物模型及氧化应激细胞模型，应用基因转染、Western blot及透射电镜等检测方法：1）证实经OGG1基因的经典DNA修复途径虽表达上调，但不足以维持BPD早期肺上皮细胞DNA稳定性；2）验证自噬系统的过度激活，削弱了OGG1特异性识别并切除DNA链中8-oxoG作用，干扰了DNA损伤修复过程；3）阐明抗氧化应激通路Nrf2表达抑制，“屏蔽”自噬蛋白p62，引发自噬事件的分子机制。最终在动物整体水平，通过靶向调节Nrf2--自噬--DNA损伤，提供改善BPD肺泡发育不良结局的早期干预途径。

支气管肺发育不良（BPD）是早产儿常见的严重并发症之一，以肺泡和微血管发育不良为主要病理特征。本项目以前期工作发现的ATⅡ细胞自噬事件为切入点，探索Nrf2 /Keap1诱导细胞自噬干扰DNA损伤修复及其发生的分子机制。在建立BPD实验模型及体外细胞培养的基础上，应用免疫荧光、Real-time PCR、Western-blot、细胞转染等分子生物学检测技术，证实自噬标志蛋白LC3B-II、p62、Lamp1的表达增加，内质网应激反应蛋白ATF4、CHOP水平升高，凋亡标志蛋白caspase3表达增加，且细胞超微结构可见ATⅡ内内质网扩张、自噬小体、凋亡小体共存，表明ATⅡ的多种损伤相互作用参与BPD发生、发展。在动物整体水平，分别应用雷帕霉素、氯化锂（自噬诱导剂）及氯喹（自噬抑制剂），结果发现增加自噬流能改善BPD肺泡发育不良的病理结局，进一步研究发现，突触融合蛋白Stx17表达沉默是介导自噬流受阻的关键靶点。抗氧化应激信号通路Keap1-Nrf2-ARE在BPD的发生、发展中同样激活，虽然Nrf2及其下游反应元件HO-1、NQO1、GCLC有代偿性增高，但其激活水平，远不能达到逆转氧化应激性肺损伤所需。进一步研究又发现，除了ATⅡ自噬、凋亡外，还存在另一种损伤形式-铁死亡，并且在动物整体和细胞水平，同步证实铁死亡事件的存在：其标志物PTGS2表达增加，相关调节蛋白GPX4、FTH1表达下降，并给予Liproxstatin-1（铁死亡抑制剂）后，在BPD模型中，肺发育的评估指标RAC增高，肺泡间隔厚度降低，均证实抑制铁死亡，也可以改善BPD的发育结局。为了进一步了解Nrf2与铁死亡的调节关系，明确是否与Nrf2激活不足有关，本项目通过免疫共沉淀技术，发现Nrf2-Keap1过度结合，使其解离障碍，导致Nrf2细胞浆内潴留，转录激活ARE能力下降，参与铁死亡发生，并通过体外实验证实，进一步促进Nrf2-Keap1解离，提高ARE水平，可以逆转铁死亡的发生。此外，还发现BPD的DNA损伤中，存在γ-H2AX形成延迟，但其机制尚不清楚（继续申报国自然基金）。本研究，从新的角度揭示了BPD的分子调控机制，为临床有关BPD的有效防治途径的重新设计奠定了理论基础。