铁皮石斛花被发育相关A、B和E类MDAS-box基因表达、功能与进化的研究

Orchids is unique floral morphology includes sepal, petal, labellum (or lip) and gynostemium (or column) from outer to inner. Among them, some of the sepal and petal are similar to each other, while it is one of the most distinctive features of a highly modified petal part and is called the labellum，and is tubular sepal in Dendrobium candidum (Orchidaceae) as well. Therefore, It is an important species of a perianth D. candidum in relation to understanding the origin and evolution of angiosperm perianth..Based on the transcriptome and genome sequencing, we have obtained the A, B,E-class MADS-box transcription factor homologues EST isolated from D. candidum, which control petal and stamen identity in floral organ of the higher eudicots. .In the current project, methods of proteins interaction, gene expression, transgene will be performed and phylogenetic trees will be reconstructed.The A, B, E-class MADS-box genes of perianth development will be studied in D. candidum for the first time. The expression and functional evolution of A, B, E-class MADS-box transcription factors isolated from D. candidum and sepal, petaloid and labellum development will be explored. It is very important to correctly understand the origin and evolution of the perianth, and deep understand the origin and diversification of flowers in angiosperms.

兰科植物具有相当独特的花部形态，由外向内分别为花萼、花瓣、唇瓣和合蕊柱，部分兰花之花萼和花瓣形状极为相似，兰花花型上最大的特色之一为具有由花瓣高度特化而成的唇瓣，并且铁皮石斛还具有管状花萼。因此，兰科中铁皮石斛花被的研究对于了解被子植物花被的起源和演化过程具有重要意义。.申请者已经从铁皮石斛的转录组和基因组序列中筛选到A、B和E类MADS-box EST片段，在高等真双子叶植物花器官中，这些基因主要控制花被发育。.本项目进一步通过蛋白质互作、基因表达、转基因和进化分析等方法，首次在铁皮石斛中对花被发育相关的A、B和E类MADS-box基因进行研究，探索A、B和E类MADS-box表达模式和功能演化以及花萼、花瓣和唇瓣的发育，对正确理解花器官产生的机制以及深入了解花器官发育在进化过程中的多样性具有重要的意义。

通过用RACE方法在铁皮石斛花器官中获得8个A,B和E-class MADS-box基因的cDNA全长。进一步通过蛋白质互作验证，发现PI与AP3-B和AP3-C能够互作，AP3-A和AP3-C之间能够形成同源二聚体；AP1-A能够与SEP-A和SEP-B互作，AP1-A与AP1-B之间能够形成同源二聚体。. 通过基因表达验证，发现AP1-A基因在铁皮石斛花被中表达外也在合蕊柱中表达；AP3-A基因在铁皮石斛所有花器官中都表达；AP3-B中期和后期在花瓣、唇瓣和雄蕊原基上表达；AP3-C铁皮石斛前期在铁皮石斛所有花器官中，中期和后期在雄蕊表达明显，所以这3个AP3基因在铁皮石斛花被发育的不同时期表达不一致。. 对基因结构、蛋白质结构域进行比较分析，发现AP1-A具有paleoAPl(LPPWML)保守域，而AP1-B不具有这个保守域；AP3-C不具有保守的AP3 Motif；SEP-A只具有保守的SEP I Motif, 而不具有SEP II Motif。. 通过系统发育重建发现从铁皮石斛中分离出来的AP1-A和AP1-B基因与来自于铁皮石斛近缘种，AP3-A基因与来自于石斛杂交种中分离出来的AP3-1以及AP3-B基因与从鸽石斛中分离出来的AP3-2基因具有很高的支持率，AP3-C基因与来自于春兰龙字中分离出来的DEF2具有中等程度的支持率，PI基因与来自于细茎石斛DmPI基因以及SEP-A基因与来自石斛兰中分离出来的SEP-like基因具有很高支持率；通过进化选择压力分析，ω(dN/dS)均小于1，说明基因在进化的过程中主要经历了负选择，产生功能不同的拷贝，特别AP3基因产生了3个不同的拷贝，AP3-A，AP3-B和AP3-C MADS-box基因，说明这些重复基因发生了亚功能化和新功能化来调控铁皮石斛花萼、花瓣和唇瓣的发育。.通过用CRISPR/Cas9对基因进行编辑，用潮霉素抗性进行筛选并获得转基因阳性植株。.对铁皮石斛花被发育相关的A、B和E类MADS-box表达模式、功能以及进化进行研究，特别是兰花花型上最大的特色之一为具有由花瓣高度特化而成的唇瓣，对正确理解花器官产生的机制以及深入了解花器官发育在进化过程中的多样性具有重要的意义。