莲瓣兰大雪素（Cymbidium tortisepalum）开花相关基因克隆、表达、功能与进化研究

开花是植物界在长期的系统演化过程中产生的关键事件（key innovation），为植物的演化打开了一条全新的途径。花器官是对植物进行分类的主要依据，也是大部分重要作物的收获器官或由其发育而形成果实。.本研究用抑制差减杂交方法构建莲瓣兰大雪素（Cymbidium tortisepalum）开花相关的cDNA文库，用芯片筛选差异表达的基因，得到在大雪素中对开花起关键作用的基因。用系统树对这些基因的进化关系进行推测；用Real-time PCR进行验证，同时用原位杂交进行时空表达的验证；用RACE方法获得关键基因的全长cDNA，通过转基因方法对候选基因在拟南芥中进行功能验证，获得在大雪素花发育中具有特异功能的新基因。探索瓣兰大雪素花器官发生和发育机制，对正确理解花器官产生的机制以及深入了解花器官发育在进化过程中的多样性具有重要的意义；同时对兰花进行基因工程改造奠定基础。

本研究用转录组测序方法对莲瓣兰大雪素花原基、苞叶、花器官和授粉前后的混合样品进行测序，产生了45,165,976 reads，通过拼接获得了60,301 Unigenes，在大雪素中得到转录因子为571，其中对花发育起重要作用的64个MADS-box基因。通过生物信息学的方法，参照水稻花粉不同发育时期，把转录组中获得的与花粉发育相关的6495个基因进行了5个不同发育时期的划分。用表达谱测序的方法对苞叶和花以及授粉前后合蕊柱进行测序，获得了907个授粉前后差异表达的基因，得到早期控制子房发育相关的基因和起重要作用的调控途径，发现早期子房的发育与生长素调控有关。. 用RACE方法获得在莲瓣兰大雪素开花中起关键作用的FT，SCO1和AP1基因的全长。用RT-PCR和Real-time PCR在生长素传导途径中上下调的基因以及其他基因进行了验证，与表达谱的结果相一致。通过基因表达发现促进植物开花的功能预测为FT和AP1基因在莲瓣兰大雪素合蕊柱中也表达。用原位杂交对控制开花的FT和SCO1进行时空表达的验证；通过转基因方法对SCO1和FT基因在拟南芥中进行了过量表达，获得FT转基因提前开花的植株。说明在多年生的大雪素花发育中对开花起促进作用的FT基因与其他植物的FT基因的功能是保守的。用系统树对功能预测为FT，SCO1以及AP1基因的进化关系进行推测并对结构域进行分析，用Maximum likelihood (ML)和Neighbor-Joining (NJ)构建系统树，从莲瓣兰大雪素中分离出来的FT基因并没有与从其他兰科中分类出来的基因具有支持率，而是与从大豆和小果野蕉中分类出来的基因具有支持率；从蛋白质的结构分析发现与其他的FT蛋白一样，在C末端具有P-loop结构域。通过系统发育重建发现从莲瓣兰大雪素中分离出来的SCO1和AP1基因与其他兰花中分离出来的SCO1和AP1具有支持率。从蛋白质的结构分析发现与其他的SCO1和AP1蛋白一样，具有MADS-box保守的蛋白质结构域，同时AP1在C 末端存在单子叶植物APl/SQUA 基因所特有的paleoAPl（LPPWML）结构域。另外，AP1基因在合蕊柱中的表达与经典ABC模型是不一致的。因此推测经典ABC模型在真双子叶之外的兰科中可能是不成立的，这对正确理解花器官发育在进化过程中的多样性具有重要的意义。