胶原抗冻多肽分子结构及抗冻机理的研究

Antifreeze protein (AFP) as an effective additive can be used in processing, distributing and storing process of frozen food to improve food quality. However, some present AFPs have the disadvantages of high cost and low yield, which limits their implementation. At the same time, the structure and mechanism of AFP also has not been investigated comprehensively. Therefore, studies on AFP mechanism at the molecular level and designs of a new AFP with high specificity have become instant challenges in food industry. In this study, poultry and livestock byproducts with large number of collagen are considered as reasonable resources for AFP. Controlled enzyme-hydrolysis and "cooling rod" specific affinity adsorption technology are used to screen antifreeze polypeptides from enzymic hydrolysates. The screened antifreeze polypeptides structure is investigated by mass spectrometry, nuclear magnetic resonance (NMR), and x-ray diffraction. Based on the structural information of the screened high-activity antifreeze polypeptides, molecular docking techniques and quantum chemical calculation methods are used to theoretically investigate the interactions between the target peptides and ice. And then experimental tests with site-directed mutagenesis methods and application results for antifreeze polypeptides in frozen food will be considered to evaluate the interactions, which will be used to clarify the antifreezing mechanism of antifreeze collagen polypeptides. This study will provide an effective way to value-added process of poultry and livestock byproducts, and introduce a new approach to screening antifreeze collagen polypeptides.

抗冻蛋白(AFP)可作为有效的抗冻添加剂应用于冷冻冷藏食品的加工、运输及贮藏过程，以提高食品的质量。然而目前已有的AFP产量低且成本高，对其结构和作用机理的研究也不完善，因此从分子水平上研究AFP的抗冻机理并针对性设计新一代高特异性的抗冻肽是目前亟待解决的问题。本项目正是以这一重要科学问题为切入点，提出以畜禽下脚料中胶原蛋白为原料，系统研究可控酶解联用"冷棒"特异性亲和吸附技术对胶原抗冻肽的高效筛选，并通过质谱、核磁共振及X-射线衍射分析探讨其结构特征；在获得高活性的抗冻多肽结构信息的基础上，应用分子对接技术及量子化学计算方法从理论上探讨目标肽与冰晶的相互作用，并进一步采用肽结构定向改造技术对理论分析进行试验验证，最终结合胶原抗冻肽对冷冻冷藏食品结晶与重结晶的抑制作用，阐明抗冻肽的抗冻机理。项目的实施将为畜禽下脚料的开发利用提供合理的途径，为胶原抗冻肽的高效筛选提供新的思路。

本研究以畜禽下脚料中胶原蛋白为原料，系统研究可控酶解联用“冷棒”特异性亲和吸附技术对胶原抗冻肽的高效筛选；在获得高活性抗冻肽结构和实际应用信息的基础上，应用分子模拟法探索目标肽与冰晶的作用机理。主要结果如下：.1）采用差示扫描量热法（DSC）建立了抗冻蛋白热滞活性（THA）的测定方法。结果表明，当抗冻蛋白浓度为20 mg/ml，保留温度为0.12℃，升降温速率为10℃/min时抗冻蛋白的THA最高，为0.61℃。DSC法测定抗冻蛋白THA具有较高的稳定性、重复性和精密度。.2）确定了猪皮中胶原蛋白的制备工艺，并优化了酶法制备胶原抗冻肽的最适工艺条件。结果表明，碱性蛋白酶的最佳酶解条件为：温度为50℃，酶添加量为5% (w/v)，pH为 8.0、胶原蛋白浓度为15 mg/mL；10%水解度的酶解产物对微生物有较高的低温保护活性，其热滞活性为1.02℃，相对分子质量分布在180-1000 Da之间。.3）搭建了冷棒-特异性亲和吸附系统对酶解复合物中的抗冻肽进行特异性吸附。结果表明，在酶解复合物浓度为 1 mg/mL，吸附时间为 10 h，吸附温度为 -5℃，吸附次数为2次的条件下，所获得的胶原抗冻肽对微生物有较高的抗冻保护活性，其热滞活性达到2.76℃；经过冰亲和吸附后，胶原抗冻肽的产率为3.84%，纯化倍数为70.59，且富含Pro和Hyp。.4）获得纯化后胶原抗冻肽的结构及生化信息，并探讨其与冰晶的相互作用。结果表明，高THA活性的胶原抗冻肽在0.2%的添加浓度能显著抑制冰淇淋的重结晶，其序列为GLLGPLGPRGLL，分子量为1162.8 Da，在溶液中主要以无规卷曲存在；通过分子模拟及定向突变发现，胶原抗冻肽可与冰晶形成大量较强的氢键，并减小冰晶内部的键级，从而抑制其生长；胶原抗冻肽C末端的氧原子和Leu残基的羰基氧形成的氧平面也可能通过空间位阻影响水分子的有序排列。.5）考察了胶原抗冻肽对冰淇淋及冷冻面团生化特性及感官品质的影响。结果表明，0.5%的胶原抗冻肽使冰淇淋融化时间显著滞后，其气泡分布及大小也得到明显改善；该肽还可抑制冰淇淋的冰晶生长及重结晶，并使其玻璃化转变温度提高到-17.64℃。0.3%的胶原抗冻肽还可使面团中酵母存活率增加到54.5%，醒发时间缩短33.3%，馒头比容上升27.1%；由其制成的馒头保持较好的咀嚼性、回弹性、黏性及感官品质。