新型磁蛋白纳米微粒标记技术的化学发光酶联免疫法检测血清中DNA甲基化转移酶1

The overexpression of DNA methyltransferases may cause the hypermethylation of tumor suppressor gene promoter. The up-regulated expression is prior to the abnormal methylation patterns, which is considered to be the characteristics of tumor cells in the early molecular changes, and DNA methyltransferases may participate in the development of tumor by high DNA methylation. Therefore, the DNA methytransferases can be employed as an early tumor molecular marker, and the detection of DNA methyltransferases will be very significant for screening and diagnosis of lung cancer. In this study, the advantages of biosimulation nanotechnology, magnetic separation technology, chemiluminescence enzyme-linked immunoassay and click chemistry will be combined skillfully. First, the monodisperse Fe3O4 magnetic nanoparticles will be prepared by biosimulation chemical in-situ method based on super-biomolecules-apoferritin molecules which are ideal template architecture. Then, the monoclonal antibody of DNA methyltransferase 1 will be coupled with the magnetic particles of Fe3O4 by the strain promoted azide alkyne cycloaddition to prepare new and stable immune magnetic nanoparticles. Finally, using the new magnetic nanoparticles as the solid phase antibody, the luminol-H2O2-HRP-phenols system as an enhanced chemiluminescence detection system, the rapid enhanced chemiluminescence enzyme-linked immunoassay will be developed for determination of DNA methyltransferase 1 in serum. It will provide a new method for the rapid, sensitive and high-throughput detection of the other tumor markers.

DNA甲基化转移酶的过表达，会引起抑癌基因启动子区高甲基化，这种表达上调通常先于甲基化异常，被认为是肿瘤细胞的一个具有特征性的早期分子改变，其可以通过促进 DNA 高甲基化参与肿瘤的发生和发展。因此将DNA甲基化转移酶作为肺癌诊断的分子标志进行检测对于早期筛查和预防肺癌具有重要的意义。本项目将生物模拟纳米技术、磁性分离技术、化学发光酶联免疫分析以及点击化学方法有机结合起来，以脱铁铁蛋白为模板合成具有良好的生物相容性和分散稳定性的Fe3O4磁性蛋白纳米微粒，将其作为化学发光免疫分析的固相载体，采用点击化学技术及应变促进叠氮炔环加成反应将待测物质抗体精确高效的标记在Fe3O4磁性蛋白纳米微粒上制备新型的免疫磁颗粒。在此基础上建立一种磁性纳米酶联免疫增强化学发光分析方法，构建肺癌早期分子标志DNA甲基化转移酶快速检测平台，为批量、快速、准确测定癌症其他早期分子标志奠定坚实的基础。

DNA甲基化转移酶的过表达，会引起抑癌基因启动子区高甲基化，这种表达上调通常先于甲基化异常，被认为是肿瘤细胞的一个具有特征性的早期分子改变，因此将DNA甲基化转移酶作为肺癌诊断的分子标志进行检测对于早期筛查和预防肺癌具有重要的意义。本项目将纳米技术、磁性分离技术、化学发光酶联免疫分析等方法有机结合起来，构建肺癌早期分子标志DNA甲基化转移酶快速检测平台，为批量、快速测定癌症其他早期分子标志奠定坚实的基础。主要内容包括以下三个方面：.（1）以脱铁铁蛋白为模板合成具有良好的生物相容性和分散稳定性的Fe3O4磁性蛋白纳米微粒，并对其外貌形态、粒径大小、磁性等进行表征，结果显示合成的磁铁蛋白分散性生物相容性较好，具有一定的磁性，在生物医学上具有较好的应用前景。.（2）将DNMT1的单克隆抗体（McAb）修饰于羧基Fe3O4磁性纳米颗粒表面制备Fe3O4@McAbDNMT1免疫分离固相物质，建立基于磁性标记的化学发光酶免疫分析检测DNMT1的方法（MCLEIA），结果显示该法线性范围较宽（0.5-128.0ng/mL），检测限为0.01 ng/mL；板内和板间精密度分别为14.3%-18.1%和15.8%-16.9%；板内和板间回收率范围分别为69.98%-106.21%、78.44%-116.77%，与DNMT3a和DNMT3b的交叉反应率分别为0.31%和0.34%，特异性好。.（3）将DNMT1单克隆抗体和DNMT1多克隆抗体分别修饰于羧基Fe3O4磁性纳米颗粒和Cd/Se量子点（QDs）表面，制备免疫复合物，在此基础上建立了基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法（FLISA），结果显示在最佳条件下 FLISA法标准曲线的线性范围较宽（0.1~1500 ng/mL），检测限较低（0.1 ng/mL），批内和批间相对标准偏差RSD范围分别为5.45%~11.29%和7.03%~11.25%，批内和批间回收率分别为91.67%~106.50%和92.18%~108.50%，与DNMT3a和DNMT3b的交叉反应率分别为4.0%和9.4%，特异性好。.在实际样品检测中，与商品化的ELISA比较，结果显示本研究所建立的MCLEIA和 FLISA方法的检测线性范围宽，检测限低，精密度和准确度较好，特异性好，检测时间短，适用于大批量样品中DNMT1的检测。