雌激素调控肺动脉内皮平滑肌细胞BMPR2启动子区甲基化水平影响遗传性肺动脉高压发病的研究

Heterozygous mutations of bone morphogenetic protein type II receptor, BMPR-II (BMPR2), cause heritable pulmonary arterial hypertension (HPAH). Low penetrance and high incidence of female are the two major features of HPAH. And the mechanisms are unknown. Our previous studies show that the hypermethylation of wild-type alleles occurs in the affected HPAH compared to their unaffected mutation carriers. Literature studies support that the estrogen affects the methylation status in some special genes. Therefore, the hypothesis of the present study is that estrogen may influence the methylation status of BMPR2 promoter in the mutation carriers. Hypermethylation of BMPR2 promoter may inhibit the expression of the wide type allele of BMPR2 gene in the female mutation carriers and therefore inducing the HPAH phenotype. In order to verify our hypothesis, the function of estrogen on the methylation status of BMPR2 promoter will be studied in the cultivated pulmonary arterial smooth muscle cells and endothelial cells, monocrotaline induced PAH models, BMPR2 knock out rat and isolated human circulating pulmonary arterial endothelial cells. The transcriptive factors, such as SP3 and methylation transferaser DNMT3b will be confirmed to involve these processes or not. The influence of estrogen to the cells proliferations and hemodynamics will be investigated. Whether methyltransferase inhibitor can be used to treat HPAH will be studied. This study can not only reveal the pathogenesis of HPAH, but also provide a new way for the treatment of HPAH.

骨形成蛋白II型受体（BMPR2）杂合基因突变是遗传性肺动脉高压的致病原因。BMPR2突变外显率低和女性高发是遗传性肺动脉高压的两大特点，机制不明。本人前期研究发现BMPR2启动子区存在不同等位基因特异性甲基化现象，突变携带者野生型等位基因高甲基化与外显相关。文献支持雌激素可影响特定基因启动子区甲基化状态。本课题提出雌激素可能影响突变携带者BMPR2野生型等位基因启动子区甲基化水平，重新改写携带突变女性唯一正常功能的BMPR2基因启动子区域的甲基化水平，引起肺动脉高压发病。本课题拟通过体外培养肺动脉血管内皮平滑肌细胞，野百合碱造模，BMPR2基因条件敲除大鼠及外周循环血中分离人肺动脉内皮细胞，探讨雌激素对BMPR2启动子区甲基化的影响；是否通过动员转录因子SP3等，调控DNMT3b参与上述过程，进一步影响BMPRII蛋白表达，细胞增殖，肺循环功能；验证甲基化转移酶抑制剂是否具有治疗作用。

遗传性肺动脉高压（Heritable Pulmonary Arterial Hypertension，HPAH）是常染色体不完全显性遗传疾病。骨形成蛋白II型受体（BoneMorphogenetic Protein Type II Receptor，BMPR-II，基因BMPR2）等基因的突变是HPAH的致病原因。BMPR2突变引起HPAH的外显率约为10%-20%。外显率低意味着不是所有的携带者均会发展成患者，同为突变携带者，有人发生肺动脉高压，而有人表型完全正常。突变携带者发病的概率为10%-20%。男性BMPR2突变携带者的外显率约为14%，而女性携带者的外隐率高达42%。何种因素影响BMPR2突变携带者外显是本课题的科学问题。.由于女性PAH的中位年龄为36岁，许多女性突变携带者在怀孕后发生HPAH。怀孕是女性性激素波动最显著的时期。雌二醇和黄体酮在妊娠期逐渐增加，峰值是非妊娠期的100倍以上。本课题探索了雌孕激素，尤其是黄体酮对处于不同BMPR2突变状态的PASMC的影响，我们用shBMPR2慢病毒或siBMPR2感染或转染PASMC，以模拟BMPR2杂合突变的病理条件。将HPAH患者衍生的诱导多能干细胞（iPSCs）诱导成血管平滑肌细胞（VSMCs），以进一步验证细胞表型。培育野生型flox+/-小鼠和SM22 cre BMPR2 flox+/-鼠，并给予黄体酮，以探讨黄体酮对体内肺动脉重塑和右心压力的影响。野生型flox+/-雌性小鼠和SM22 cre BMPR2 flox+/-雄性小鼠（CKO小鼠）给予黄体酮一个月，并通过右心导管术和组织病理学检查进行血流动力学评估及肺血管增殖情况评估。 研究发现黄体酮通过孕激素受体（PGR）激活ERK通路，促进BMPR2敲除PASMC的增殖，但不促进正常PASMC的生长。激活的ERK不仅诱导cMYC的磷酸化和升高，而且通过促进c-JUN的核进入及其启动子区的结合，诱导内皮素（EDN1）的转录。iPSCs VSMCs实验也显示出类似的结果。CKO小鼠自发产生PAH，EDN1表达增加，外源性孕激素进一步加剧了这种情况。.因此，本研究证明在BMPR2缺乏的PASMC中，孕酮可以通过PGR-ERK-cMYC/EDN1轴促进平滑肌细胞增殖。外源性黄体酮可加重CKO小鼠自发的PAH表型。黄体酮可能是BMPR2突变导致的HPAH