Neddylation蛋白修饰对动物流感病毒急性肺损伤的免疫调控

Acute Lung Injury (ALI) is one major reason of the morbidity and mortality of influenza virus infection in animals. However, the mechanism of immune regulation in lung microenvironment is not clear. Based on the former studies, we are planning to establish ALI models in swine, chickens, ducks and mice. Using CRISPR/Cas9 Knockout plasmids, NAE1 inhibitor MLN4924, siRNAs against Cullin-RING-E3 (CRL) pathway and immunological methods (Western-blot, FACS and confocal microscope) to study the effects on NEDD8-CRL pathway of lung immune cells, primary respiratory cells and lung cell lines, and then quantify the levels of NF-κB pathways and cytokines. The results of this study have potential benefits on molecular pathogenesis, immune responses and regulatory mechanisms and novel drug targets for influenza control.

A型流感病毒导致急性肺损伤是其致病的主要原因之一，而在急性肺损伤过程中，流感病毒导致的肺部微环境免疫调控机制尚未明确。本研究结合前期研究结果，拟构建实验动物急性肺损伤模型（猪、鸡、鸭、小鼠），利用CRISPR/Cas9敲除技术、NAE1特异性抑制剂MLN4924、siRNA干扰技术，在体内外研究流感病毒与Neddylation蛋白修饰Cullin-RING E3连接酶（CRL）通路的互作，进而根据NF-κB通路和细胞因子量化指标，明确Neddylation蛋白修饰对动物流感急性肺损伤的免疫调控机制，并从NEDD8修饰差异性研究，从宿主角度解释猪、鸡、鸭和小鼠对流感病毒致病性差异的科学问题。其研究结果对于流感病毒分子致病性、免疫调控机制和药物新靶标研究有重要指导价值。

急性肺损伤和细胞因子风暴是流感病毒导致人类和动物发病死亡的重要原因，但缺乏对其致病机制的研究。Neddylation蛋白修饰通路在炎性反应和抗感染免疫中发挥重要的调控作用。然而，流感病毒与Neddylation修饰通路的互作研究鲜有报道。本研究拟通过Neddylation蛋白修饰为流感病毒的致病分子机制提供新方向。.具体研究结果如下：.1、为了获得适应哺乳动物细胞且炎性反应较强的低致病性H9N2亚型禽流感病毒，4株不同宿主来源的H9N2亚型病毒在SPF雏鸡和Balb/c小鼠进行了致病性实验。最终确定A/swine/Jiangsu/C1/08（H9C1）株为后续研究Neddylation修饰用的H9N2亚型模式毒株。.2、为了明确流感病毒感染宿主细胞后Neddylation蛋白修饰通路的变化，H9C1、A/California/04/09（maCa04）病毒感染A549细胞。结果显示：H9C1和maCa04流感病毒在感染早期（4~6h）激活了Neddylation蛋白修饰通路。.3、为了探明Neddylation蛋白修饰对流感病毒的复制及致病性影响，利用Nedd8活化酶特异性抑制剂MLN4924处理A549细胞和Balb/c小鼠，然后分别感染不同流感病毒。MLN4924抑制剂处理后，流感病毒的复制能力、炎性反应明显降低；强毒株（maCa04和PR8）感染组有20 %小鼠得以存活。.4、为了阐明流感病毒蛋白与Neddylation通路之间的互作关系，利用Cullin-1敲低细胞系感染流感病毒，发现病毒滴度明显升高，进一步研究表明Cullin-1与NS1存在互作关系，且Cullin-1负调控NS1。NS1极有可能劫持Cullin-1-RING E3连接酶复合体，负调控CRL1对其他病毒蛋白的降解作用。.5、为了探索CRLs蛋白酶复合体对流感病毒复制的影响，本研究对CRLs复合体中的关键骨架蛋白一系列Cullins蛋白进行敲除或者敲低，获得了NAE-1，UBC12及Cullin-1的A549敲低细胞系和Cullin-2敲除的A549细胞系。利用这些细胞系感染流感病毒，发现：NAE1、UBC12及Cullin-1敲低促进流感病毒的增殖，而Culin-2敲除对流感病毒复制没有影响。