典型唑类抗真菌剂在斑马鱼中的富集代谢规律及其性腺激素干扰效应研究

Azole fungicides are widely used as antifungal active ingredients in pharmaceuticals and personal care products. In recent years, azole fungicides have received increasing attention because of their presence in the fisheries environment. The related research mainly focused on the occurrence of azole fungicides in the aquatic environment, while limited data about their bioaccumulation and metabolism in fish are available. It has been reported that azole fungicides could disturb the steroidogenesis in adult fish. However, the sex hormone disrupting effects on early development stage of fish or the potential toxicological effects on their progeny following parental exposure to azole fungicides have not been shown. The research object is to investigate the bioaccumulation, metabolism and sex hormone disrupting mechanisms of typical azole fungicide on different development stage of zebrafish (F0 eleutheroembryo, F0 juvenile, F0 adult and the corresponding F1 eleutheroembryo), using high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry and real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction. Based on the results of chemical and biological analysis, the adverse effects of azole fungicides on fish can be elucidated. This research provides the significant data for assessing the risk of azole fungicides to the fisheries environment.

近年来，唑类抗真菌剂作为抑制真菌的活性成分广泛应用于药物与个人护理品，其引起的渔业环境污染受到人们的关注。国内外研究主要集中于它们在水环境中的污染特征，而关于唑类抗真菌剂在鱼体内富集代谢规律的研究十分薄弱。目前，已有报道表明唑类抗真菌剂能够干扰成年鱼类的性腺激素合成过程，但关于唑类抗真菌剂对鱼类早期胚胎发育阶段的性腺激素干扰效应以及对鱼类全生命周期（从胚胎到成鱼）暴露所产生的潜在子代毒理效应研究相对滞后。针对以上现状，本项目将在前期研究基础上选取典型唑类抗真菌剂，以斑马鱼为模型，利用高效液相色谱串联质谱和实时荧光定量PCR等现代分析手段，研究典型唑类抗真菌剂对斑马鱼不同生长阶段（早期胚胎、幼鱼、成鱼和子代早期胚胎）的富集代谢规律及其性腺激素干扰效应，从化学和生物的角度阐明唑类抗真菌剂对鱼类的影响，为综合评价唑类抗真菌剂对渔业环境所带来的风险提供科学依据。

唑类抗真菌剂是一类用于治疗真菌感染的药物。经过使用后，它们会随着污水进入环境中，对环境生物造成潜在的影响。我们研究了北江流域环境中唑类抗真菌剂及其它重要抗菌药物的分布规律和生态风险，发现北江流域地表水中唑类抗真菌剂和抗生素的含量以及沉积物中三氯生和三氯卡班的含量相对人口密度较高的东江流域的低，说明人类活动影响着抗菌药物在水环境中的残留。水中的多菌灵和沉积物中的三氯生对北江流域河流中的水生生物造成高风险。通过建立的痕量分析唑类抗真菌剂在鱼肉中的方法，在北江流域野生鱼肌肉中检出了克霉唑、氯咪巴唑和多菌灵，在水产养殖场的鱼肉中能检出恩诺沙星和氟苯尼考，说明了抗（真）菌药物能积累在鱼类的组织中。通过危险商数法计算得出食用该鱼类摄入抗（真）菌药物不会对人体造成健康风险。实验室模拟实验表明，氯咪巴唑在斑马鱼胚胎中的富集系数随着浓度的升高而降低，低浓度暴露与中浓度/高浓度暴露的模型不一致，意味着环境中痕量的污染物会从水中向鱼组织中迁移。氯咪巴唑在环境浓度暴露下，能显著下调斑马鱼胚胎/仔鱼中与生理节律相关和性腺激素合成相关基因的转录水平。在高浓度暴露下，氯咪巴唑也能调节涉及炎症反应、氧化应激、卵母成熟和性别分化的基因的转录水平。结合PLS-DA模型，我们筛选出8个基因作为氯咪巴唑暴露的潜在生物标志物。我们通过优化数据归一化方法、提取溶剂选择和提取策略等前处理步骤，结合气相色谱串联质谱技术，提出一种具有较好提取效率和方法精密度的方法用于分析斑马鱼胚胎的代谢组。使用该方法能在斑马鱼胚胎检出270种代谢物峰，包括次黄嘌呤、缬草碱、丙酮酸和柠檬酸等重要的内源代谢物。本项目的结果为政府部门正确评价唑类抗真菌剂对环境的影响和所造成的生态风险提供了参考依据。同时，本项目所建立的分析方法为科研人员进一步研究环境污染物（例如唑类抗真菌剂）对斑马鱼早期发育阶段的代谢紊乱机制提供了基本工具。