玉米转脂蛋白新成员ZmLTP3的抗盐功能及其上游调控机制研究

The functions of plant lipid transfer proteins (LTPs) in abiotic stresses and regulation networks are little reported. In our previous studies, Arabidopsis overexpressing ZmPto/ZmPti1 enhanced resistances to abiotic stresses, meanwhile, the expression level of LTP3 in transgenic lines increased dramatically. The expression of LTP3 in Pti1 mutant lines decreased, indicating LTP3 may be in the downstream of Pti1 signal pathway and participate in the abiotic stresses resistance. Additionaly, Arabidopsis overexpressing maize ZmLTP3, a homologue to LTP3, enhanced the resistance to salt. In this study, overexpression and RNAi methods will be used to transform maize. The functions in salt resistance of ZmLTP3 will be analyzed in transgeic maize. The promoter of ZmLTP3 will be cloned and characterized. Using yeast one-hybrid system, the transcript factors binding to promoter will be isolated from maize cDNA library, and verified by EMSA and ChIP-PCR, clearing the upstream regulation components of ZmLTP3. The expression levels of ZmLTP3 will be analyzed in ZmPti1 overexpression and RNAi maize lines to study the relationship of ZmPti1 and ZmLTP3 in maize. Lastly, yeast one-hybrid system, BiFC and the phosphorylation ability of ZmPti1 to the transcript factors will be analyzed to investigate the regulation mechanisms of ZmPti1 to ZmLTP3.

植物转脂蛋白（LTPs）在非生物胁迫中的作用及其上游调控机制鲜有深入报道。前期研究发现，过量表达ZmPto/ZmPti1的拟南芥抗盐性增强的同时LTP3表达剧增，而拟南芥Pti1突变体中LTP3表达下降，暗示LTP3是Pti1的下游组分且参与抗盐性的调节；转玉米ZmLTP3基因(类LTP3序列)的拟南芥抗盐性提高。本研究拟利用超表达和RNAi技术获得转基因玉米，明确ZmLTP3在玉米中的抗盐功能；克隆ZmLTP3启动子，通过酵母单杂交从玉米cDNA文库中筛选与之作用的转录因子，并经EMSA，ChIP-PCR进行验证，探讨ZmLTP3上游调控组分；分析ZmLTP3在过量和抑制表达ZmPti1的转基因玉米中的表达情况，确定ZmPti1和ZmLTP3的上下游关系；通过ZmPti1对ZmLTP3上游转录因子的酵母双杂交、BiFC及磷酸化检测，初步探讨ZmPti1对ZmLTP3的调控机制。

大量报道表明Pto/ Pti1 参与植物抗病信号，之前的研究发现玉米中Pti1 (ZmPti1)可以诱导一个转脂蛋白基因ZmLTP3的表达。证据显示ZmLTP3参与非生物逆境信号。本项目经过4年研究，明确了玉米ZmLTP3的生物学功能和上游调控机理。主要研究结果如下：1）通过构建过量表达及RNAi抑制载体，转化玉米株系，对转基因株系分析证实ZmLTP3基因在玉米对干旱和高盐的响应过程中起到非常重要的作用；2）通过克隆启动子片段及不同截断片段转化拟南芥，确定了ZmLTP3基因启动子的核心功能区，进一步构建cDNA文库，通过酵母单杂交试验筛选出与核心功能区互作的蛋白质因子（命名为ZmLSD1），并经过EMSA及ChIP-PCR分析试验加以验证，RT-PCR分析显示ZmLSD1在不同组织器官中都有表达，且受多种逆境因素的诱导；3）在过量及抑制表达ZmPti1基因的转基因株系中，对ZmLTP3基因的表达水平进行RT-PCR分析，证实了ZmPti1存在于ZmLTP3基因上游，并调控其表达；4）酵母双杂交及BiFC试验验证了ZmPti1和ZmLSD1之间的相互作用关系，体外磷酸化试验表明ZmPti1不但具有自我磷酸化的功能，还具有磷酸化ZmLSD1的功能。强烈暗示ZmPti1可能通过调控ZmLSD1的活性来实现对ZmLTP3基因的表达调控。本研究不但明确了ZmLTP3基因的功能，并初步探讨其作用机制，而且，还为下一步明确 LTPs在Pto/Pti1信号网络中的确切位置及作用奠定基础。