结核分支杆菌感染相关microRNAs的筛选、鉴定及其在抑制巨噬细胞凋亡中的作用研究

结核分枝杆菌(Mtb)是结核病发生的主要病原菌，感染人体后可通过抑制巨噬细胞凋亡以逃避其杀伤，引发持续感染，但具体作用机制尚不清楚。MicroRNA(miRNA)作为新发现的一类内源性调控因子，广泛参与调控各种应答。我们前期研究发现Mtb感染的人巨噬细胞miR-155的表达上调；进而发现过表达miR-155时其靶基因：FADD、SMAD2、IKK-ε被显著抑制，提示miR-155可能参与调控凋亡信号通路。本项目拟建立不同毒力株Mtb感染巨噬细胞模型，通过miRNA芯片、Northern杂交和定量PCR技术，筛选并鉴定Mtb感染诱导的miRNA；通过生物信息学预测和报告载体实验鉴定其靶基因；并通过过表达或抑制实验分析其负性调控功能，探讨Mtb感染抑制巨噬细胞凋亡的作用机制。研究"Mtb感染、miRNA变化与凋亡抑制"的作用模式和机制，对进一步阐明Mtb持续性感染的分子致病机制具有重要意义。

结核分支杆菌（MTB）作为结核病发生的主要病原菌，主要感染人肺巨噬细胞，可通过多种途径逃避其杀伤，引发持续感染；MiRNA作为新发现的一类内源性调控因子，广泛参与调控机体的各种应答。我们开展了MTB感染相关miRNA的研究。1.首先建立MTB感染人巨噬细胞模型，将感染组与对照组Total RNA用于miRNA芯片检测，筛选出18个表达明显差异的miRNAs：其中8个上升，10个下调；采用荧光定量PCR方法对表达上调的明星分子“miR-146a”进行定量检测：miR-146a上调了2.7倍(P<0.01)。2.经支气管镜收集活动性肺结核病人和对照组肺泡灌洗液，定量PCR检测结果显示：痰菌阳性病人miR-146a表达水平最低，其次是痰菌阴性肺结核病人，二者均低于正常对照；此外肺结核病人肺泡巨噬细胞miR-146a的水平与痰菌阳性程度呈负相关。3. miR-146a基因启动子预测结果表明miR-146a启动子序列中含有多个NF-κB结合位点；构建miR-146a启动子序列荧光素酶报告载体，结果显示BCG刺激显著增加荧光素酶值；当序列中NF-κB结合位点发生突变，其对应的荧光素酶值显著降低(P<0.05)；表明NF-κB信号通路参与了BCG诱导miR-146a的表达。4.应用软件预测miR-146a的靶基因，初步筛选出miR-146a在巨噬细胞中的潜在作用靶点：IRAK1、TRAF6、PTGS2；成功构建了IRAK1、TRAF6、PTGS2靶基因的荧光素酶报告载体和GFP报告载体；结果显示miR-146a能与靶基因的3′-UTRs结合，从而抑制报告基因的表达。5. IRAK1、TRAF6为TIR受体下游线性级联途径的关键衔接蛋白；PTGS2为启动炎症发生的关键酶，提示miR-146a可能在BCG感染的炎症反应中发挥调节作用，本实验将功能研究由凋亡调至炎症调控。结果显示miR-146a mimics显著减少BCG感染引起的炎症因子TNF-α (P<0.05)和BCG感染引起的NF-κB的活性(P<0.01)；且能够显著减少BCG感染炎症中PTGS2的表达和减少细胞内BCG的菌量。综上所述，miR-146a作为一类新的负反馈调节因子，与其靶基因构成全新的基因调控网络，参与Mtb感染中炎症反应的调节过程，这为进一步阐明Mtb感染的免疫调控机制及Mtb的致病机制研究提供新的方向。