AMETH_3452基因在放线菌系统发育中的应用研究

The phylum Actinobacteria, as one of the largest groups of bacteria, is related to the environment of human disease, and antibiotic production, and its taxonomy is of great importance. 16S rRNA gene is defective due to the multiple copies with diversity and horizontal transfer. Massive information of nucleotide and protein sequences offers a variety of possibilities in classification methods under the genomic era, and has corrected 16S rRNA classification method in several genera and species levels. Based on the previous study, one novel actinobacterial specific conserved gene, AMETH_3452 was found in genus Amycolatopsis. We constructed phylogenetic analysis tree within this genus by AMETH_3452 and obtained more accurate branches structure, compared with protein sequence concatenation and 16S rRNA gene phylogeny. In this study, extensive experiments will be carried out to verify the function of AMETH_3452 as identification markers of actinomycetes. We also want to provide a set of rapid methods for actinomycetes identification. On the other hand, the application of AMETH_3452 gene in the phylogenic analysis of Actinobacteria was studied alone or by combining with other conserved orthologous genes at different classification scales. In addition, AMETH_3452 gene is not only highly conserved but also has a special position in the middle of the circular genome. Thus the project will explore the physiological function of the gene by molecular microbiology and bioinformatics analysis. In a word, AMETH_3452 has vital application value for the identification and phylogenetic analysis of actinomycetes.

放线菌门作为细菌最大的类群之一，关系到人类疾病、环境及抗生素生产，其分类学研究非常重要。16S rRNA基因具有株内差异化的多拷贝且存在水平转移，而基因组时代下核酸及蛋白序列的海量信息给分类方法提供了多种可能性，在个别的科、属、种的水平内已经修正了16S rRNA分类方法。申请人前期在拟无枝菌酸菌属中发现了放线菌特异的AMETH_3452基因并在该属中进行系统发育分析，相比蛋白串联和16S分析方法，取得了更准确的分支结构。本项目在此基础上，将该基因作为放线菌鉴定标识物进行广泛的验证，并提供快速鉴定方法；另外在不同分类尺度下，通过单独或组合其他保守基因的方式研究它作为分子标识物在系统发育中的应用。该基因不仅高度保守且处于环形基因组中间位置，本项目拟采用分子微生物学和生物信息学分析手段对该基因的生理功能进行初步的探究。总之，该基因显示出对于放线菌的鉴定及系统发育分析具有重要的应用价值。

AMETH_3452基因是团队前期从拟无枝酸菌中发现的一个存在于放线菌的保守基因，位于拟无枝酸菌属中的环形基因组中间位置。为了探寻其生理功能，针对Mycobacterium smegmatis MC2 155菌株进行了同源基因敲除，但是未发现表型变化，推测不是影响生长代谢的关键基因。本研究将该基因构建在pET-28载体上，在大肠杆菌中蛋白表达成功并进行了纯化，可为进一步的蛋白结晶提供基础。AMETH_3452基因在拟无枝酸菌属的核酸同源性在79.23%—99.02%之间，在300bp—600bp之间的序列一致性较高。因此设计了特异引物，进行qPCR的检测，以此开发了基于AMETH_3452基因对拟无枝酸菌的核酸检测方法。AMETH_3452蛋白序列具有269个左右的氨基酸，在本项目中构建了其同源蛋白数据库。作为分子标记在76个拟无枝酸菌中进行系统发育分析后发现，东方拟无枝酸菌分支和甲基拟无枝酸菌分支稳定性高，同时可将东方拟无枝酸菌分支分成两个可稳定的分支AORIS和AMEDS。在放线菌的其他属也进行了系统发育分析，例如Pseudonocardia分成3个分支，能够将Saccharomonospora和Saccharopolyspora有效分开，在Corynebacterium中可以获得3个稳定的分支等。另外，探索了飞行时间质谱对拟无枝酸菌的鉴定和聚类方法，建立了拟无枝酸菌的自建库，提高了检测准确度。为了更好的完善该基因数据库，本项目对Amycolatopsis acidiphila进行了测序，获得了8,183,622bp大小的基因组完成图。GC含量为70.4%，并发现了20个次级代谢基因簇，包括4个NPRS基因簇。此外，针对细菌对抗生素的耐药性开展了研究，在食源性致病菌中发现了一系列的新流行的获得性耐药基因。本项目初步建立了以AMETH_3452为分子标识物的放线菌特定类群的分类及系统发育体系，为结合传统分类并完善分类系统提供理论基础；为AMETH_3452基因下一步作为检测环境、动物或临床上的放线菌和系统发育应用研究提供依据。