牙菌斑生物膜相容性基因的筛选

牙菌斑是一种典型的生物膜，其内存在正常菌群，细菌之间的相互作用决定牙菌斑生物膜内定植的细菌种类。细菌之间通过协同利用生态位点、营养物质、合成共生因子及信息分子等共存于牙菌斑生物膜内，相关的基因为牙菌斑生物膜相容性基因。尽管已筛选出一些参与牙菌斑生物膜形成的基因，但都是针对单菌种进行的研究，需从牙菌斑宏基因组的角度，对多菌种构成的生物膜进行全面、系统的研究。首先构建牙菌斑总基因组fosmid文库，将文库加至牙菌斑菌群中，分离出能与菌群共生于生物膜内、携带fosmid的E.coli，在筛选出的fosmid中可能含有牙菌斑生物膜相容性基因。随后将筛出的基因插入表达质粒，转化E.coli，通过体外生物膜形成实验以及动物实验，验证基因的相容性，即基因编码的蛋白使非牙菌斑固有菌E.coli能相容于牙菌斑菌群，共生在有限的生态位点，形成牙菌斑生物膜。将为理解牙菌斑内正常菌群的形成、细菌之间的相互作用。

本项目研究内容主要包括以下两个方面：①构建宏基因组Fosmid文库筛选牙菌斑培养菌群抗生素耐药基因。研究采集20例无龋健康人的集合牙菌斑并进行厌氧培养，提取牙菌斑培养菌群宏基因组构建宏基因组Fosmid文库，用卡那霉素、四环素、氨苄青霉素三种抗生素对文库进行筛选。对筛选到的Fosmid克隆进行Fosmid末端测序、亚克隆文库构建、筛选、阳性亚克隆测序和序列分析。课题建立了多菌种的牙菌斑培养菌群，以该菌群基因组DNA为插入片段来源，构建了牙菌斑培养菌群宏基因组Fosmid文库，插入片段长度在36到48kb间约有15120个克隆，插入片段长度小于36kb约有3360个克隆。从文库中筛选到了3条具有抗生素耐药功能的序列，分别是含有双功能乙酰转移酶和磷酸转移酶基因的序列（卡那霉素耐药）、含有四环素核糖体保护蛋白基因tet（M）的序列（四环素耐药）和内含可诱导C组-内酰胺酶基因的序列（氨苄青霉素耐药）。并且前两个耐药序列中分别含有IS256转座酶基因和接合转座子蛋白基因，而在氨苄青霉素耐药序列中含有转录调控因子基因。研究证实了可以通过构建宏基因组Fosmid文库的方法来筛选牙菌斑培养菌群中细菌的抗生素耐药基因。②通过宏基因组测序分析揭示与牙周病相关的口腔微生物群落及其潜在的功能。尽管大量研究报道了某些细菌和人类口腔疾病之间的关系，但对与口腔疾病相关的微生物群落的种类、功能组成，至今缺乏系统的研究认知。本研究中，我们采用宏基因组学方法来研究与牙周健康和疾病相关的微生物群落的结构和功能，应用测序分析手段对牙周健康和患有慢性牙周病的牙菌斑样本进行宏基因组测序，通过对代表4种牙周状态的来自于牙周菌斑生物膜的16个样本的基因组序列的对比分析，证实在微生物群落结构与牙周健康和疾病状态之间存在很强的相关性，并发现了与牙周疾病相关的一组核心微生物群落。证实在牙周病微生物群落中，许多功能基因和代谢途径过表达，其中主要涉及细菌趋化、鞭毛组装和毒素生物合成相关的功能基因和代谢途径。此外，通过宏基因组组装还鉴定出一些新的物种和功能基因。本研究获得的这些物种类群及其功能是尚未被发现的，这些新的微生物物种，尤其是新的基因，可以提供更多的线索来了解人类口腔疾病的形成和发展。因此，本研究结果丰富了我们对人类口腔微生物的理解，揭示了在人类牙菌斑生物膜及其相关的口腔疾病形成与演替过程中微生物群落的作用。