Dex和Gtf直接相互作用的机制及其对牙菌斑生物膜致龋性影响的实验研究

胞外多糖是牙菌斑生物膜形成发展、致龋最重要的物质基础。右旋糖酐酶（Dex）对葡糖基转移酶（Gtf）产生的胞外多糖有明显的调节作用。申请者以前期实验发现的"外源性Dex能明显抑制Gtf活性"为出发点，联系Dex能直接结合Gtf的初步证据，探索Dex和Gtf直接结合（蛋白质相互作用）对胞外多糖代谢平衡的影响及机制研究。本课题综合使用同源重组、层析法、ELISA、IP-Western、RT-PCR、激光共聚焦、同位素荧光标记、化学交联结合质谱分析等技术，研究①Gtfs和Dex直接结合的机制，②Gtfs与Dex的相互调节作用，③这种直接结合调节作用的效应及其对牙菌斑生物膜致龋性的影响。本课题通过研究变异链球菌自身的Dex和Gtf的直接结合，来探讨Dex和Gtf间相互作用的机制、对酶活性及其胞外多糖代谢平衡的影响，对阐明牙菌斑生物膜形成发展的分子机制和寻找新的防龋方法具有重要的理论意义和应用前景。

目的：本课题拟通过重组表达变异链球菌DexA蛋白进行pull down实验，构建dexA缺陷株（SmudexA）和dexA过表达补偿株（SmudexA+），研究dexA对vicRKX信号通路相关基因、gtfB/C/D的调节作用，及其对牙菌斑生物膜结构的影响，初步探索DexA蛋白与GtfB/C/D的直接结合机制，探讨Dex和GTFs直接相互作用机制及其对牙菌斑生物膜致龋性的影响，为防龋疫苗的研究奠定基础。..材料和方法：重组表达DexA蛋白，与变异链球菌菌体蛋白与胞外蛋白分别进行pull down实验；以变异链球菌Ua159野生株为对照，通过PCR连接诱变技术构建SmudexA，穿梭载体克隆技术构建SmudexA+和dexA缺陷回复补偿株（SmudexAr）；观察Ua159野生株，SmudexA株，SmudexA+株和SmudexAr株的生物学性能、生物膜性状及vicRKX信号通路相关基因和gtfB/C/D基因的基因表达水平的改变。..结果：电泳结果和 western bloting 结果表明DexA蛋白表达成功。His-tag pull down实验未检测到DexA蛋白和GtfB/C/D的直接结合作用。Ua159野生株，SmudexA株，SmudexA+株和SmudexAr株的24小时生长曲线无统计学差异（P<0.05）；生物膜结晶紫染色、激光共聚焦和扫描电镜结果显示，SmudexA株生物膜结构改变，主要表现为多糖显著增多，SmudexA+株生物膜结构与Ua159野生株无明显差异；荧光定量PCR结果显示，SmudexA株vicRKX信号通路相关基因和gtfB/C/D基因较Ua159野生株均表达上调（P<0.05），SmudexA+株和SmudexAr株较Ua159野生株表达水平无统计学差异。..结论：dexA基因可通过调节vicRKX信号通路相关基因和gtfB/C/D基因的基因表达水平，改变变异链球菌胞外水不溶性多糖量而改变生物膜结构，而对变异链球菌的生长无明显影响。DexA蛋白与GtfB/C/D蛋白的直接结合机制仍需继续探索。