I型干扰素依赖的病毒刺激诱导的长链非编码RNA在抗病毒天然免疫应答中的功能及机制研究

The regulation of antiviral innate immune response has long been intensively explored. However, almost all of these studies are focused on the role of coidng genes while ignoring the large majority of noncoding genes,especially for long noncoding RNA.With microarray, we have explored the expression profile of lncRNA and identified a cluster of lncRNAs induced in virus infection through a IFN-I-signaling dependent manner. After function scanning with their siRNA, we found lincRNA-203 and lincRNA-220 could regulate IFN-I produciton and virus replication. This project intend to further confirm the role of these two lncRNA in vitro using stably transfected cell line and in vivo using gene-modified mice in the model of different type virus infection, SeV,VSV, HSV.Then we will investigate signaling pathways and genes regulated by these lncRNAs through immunoblot and microarray detection, and identify their interacting proteins which mediate their function through mass spectrometry and colocalization analysis. We will also explore the underlying mechanism of these lncRNAs upregualtion after virus infection through promotor analysis, ChIP,and gene reporter assay. This study will clarify the noval role of lncRNA in innate immune response and provide potential targets or markers for the therapy of clinical virus infection disease or IFN treatment.

机体抗病毒天然免疫应答一直以来是免疫学研究的重点，然而过去的研究都集中在编码蛋白的基因，目前还没有lncRNA在这方面的研究报道。前期实验我们用lncRNA表达芯片在小鼠巨噬细胞中筛选到了一批能够在病毒刺激后依赖IFN-I信号被诱导表达的lncRNA。用siRNA进行功能筛查，发现其中lincRNA-203和lincRNA-220能够调控IFN-I的产生和病毒的复制。后续将进一步用高表达和干扰稳筛细胞系、基因操作小鼠进行体外和体内多种病毒刺激后检测分析，深入研究该lncRNA在抗病毒天然免疫应答中的功能，同时检测其在人类细胞中同源基因的功能。在机制上我们将筛查其调控的信号通路转录因子、表达芯片检测其调控的基因、质谱筛查其发挥作用的结合蛋白，并探索该lncRNA在病毒刺激后表达上调的分子机制。该研究将确定lncRNA在天然抗病毒免疫中的作用和机制，为临床病毒感染和IFN相关治疗提供研究基础。

天然免疫是宿主先天具有、抵御病原微生物入侵的第一道防线。而病毒性感染是人类最常见的感染性疾病，流感、艾滋病、乙型肝炎等，严重危害了人类健康。因此抗病毒天然免疫应答一直是免疫学领域中研究重点之一。研究表明，长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在多种生理过程中行使重要的功能。本课题从lncRNA入手，试图寻找在病毒与宿主相互作用中行使重要功能的lncRNA，为临床诊断治疗病毒感染性疾病提供新思路。.当病毒入侵宿主细胞时，干扰素调节因子家族作为转录因子介导 了 IFN基因的转录表达，从而发挥抗病毒功能。其中 IRF几乎在各种细胞类型中组成性表达，其转录活性直接影响了宿主的抗病毒功能。所以，探讨抗病毒天然免疫应答中IRF3的调控机制具有重要科学价值。为此我们试图寻找与IRF3相互作用的功能性lncRNA 。.首先我们利用甲醛交联法RNA免疫沉淀技术（crosslink-RNA immunoprecipitation，crosslinked-RIP）制备了IRF3相互作用的RNA样品进行高通量测序，经过RIP二轮筛选和siRNA功能筛选，找到IRF3结合的lncRNA：AK039403（编号：lnc304）。实验发现，lnc304的表达依赖IFN-I信号，属于ISG。经过体外基因敲低实验、功能获得性实验证明lnc304可促进病毒感染时IFN-I的表达。进一步机制研究提示，lnc304定位于细胞核，并且促进了IRF3的活化状态。我们首次发现了病毒感染宿主细胞时应激表达的IFN-I可反馈性诱导lnc304的表达，lnc304在细胞核内与活化后的IRF3结合，并促进了IRF3的活化状态和转录活性，从而增强了IFN-I的表达，由此形成抗病毒天然免疫正反馈环。本课题加深了对抗病毒天然免疫应答过程中IRF3行使功能机制以及病毒调控宿主代谢机制的认识。