广藿香化学型形成的分子机制研究

Secondary metabolites are the material base of pharmacological characteristics of traditional Chinese medicine. The special chemical compositions and proportions (i. e. Chemical type) make up the formation of authentic and superior medicinal herbal. Pogostemon cablin, a famous herbal medicine, has two chemical types, pogostone-type and patchouliol-type. The authentic and superior medicinal herbal is pogostone-type, which has a better pharmacological effect than patchouliol-type. However, the formation of pogostone-type is unclear and obstructs the variety breeding. Based on previous studies, we hypothesize the “Epigenetic modification-Differential gene expression-Specific phenotype” theory is the formation mechanism of chemical types in P. cablin: Different epigenetic modifications, especially DNA methylation levels, result in the differential expression of functional genes, and hence lead to the different chemical types of P. cablin.. In this study, P. cablin seedlings regenerated from tissue-cultured stem cells and cultured in strictly controlled different greenhouse conditions are used as material. The chemical compositions, DNA methylation levels, transcriptomic expression profiling will be studied using GC-TOF/MS, GC, MSAP, qRT-PCR and Illumina sequencing technology. The regulatory network in metabolic pathways will be constructed and the differentially expressed genes regulated by different environmental conditions will be screened. The relationships among chemical compositions, gene expression levels and DNA methylation will be further invested in P. cablin seedlings treated by DNA methylation inhibitors. Based on these results, the molecular mechanism of chemical types formation in P. cablin will be discussed. This will offer a new way to study the genuineness of asexually reproduced traditional Chinese medicine and facilitate the quality control of medicinal plants.

植物次生代谢产物是中药安全有效的物质基础，特定的化学型是“道地药材”的“道地”性之所在。广藿香存在广藿香酮型和广藿香醇型2种化学型，道地药材属广藿香酮型，其形成机理尚未阐明，影响了广藿香品种的选育。课题组依据已有的研究结果，推断“表观遗传修饰-基因转录应答-特异性表型”是其化学型形成模式：由于不同品种的表观遗传修饰不同（特别是DNA甲基化水平差异），导致功能基因表达模式差异，最终产生了不同的表型即化学型。本项目拟以两种化学型广藿香组培苗为材料，严格温室控制条件下，采用GC-TOF/MS、MSAP 、qRT-PCR和Illumina测序平台等技术，考察分析生长过程中动态代谢谱、DNA甲基化水平、转录组表达谱，筛选差异表达基因，定量基因表达量，研究功能基因的调控通路；采用DNA甲基化抑制剂阻断甲基化过程，验证其调控模式。最终探讨广藿香化学型形成的分子机制，为道地药材研究提供新思路和新方法。

广藿香存在广藿香酮型和广藿香醇型2种化学型，道地药材属广藿香酮型，其形成机理尚未阐明。课题组以2种化学型广藿香组培苗为材料，严格温室控制条件下，采用GC-TOF/MS、MSAP 、MethylRAD-seq、HPLC和Illumina测序平台等技术，考察分析生长过程中动态代谢谱、DNA甲基化水平、转录组表达谱，筛选差异表达基因 ；采用DNA甲基化抑制剂阻断甲基化过程，验证DNA甲基化在广藿香化学型形成中的作用。筛选了22个差异代谢物，用于广藿香化学型的划分，其中7个差异代谢物注释到KEGG数据库中，富集于倍半萜和三萜的生物合成途径及萜类骨架的生物合成途径；组培苗从210 天开始，醇型广藿香百秋李醇含量开始显著高于广藿香酮含量，确定了210天为组培苗化学型分型的重要时间拐点；2个化学型显著差异表达的转录因子主要为AP2/ERF-ERF、WRKY、C2H2和bHLH，与萜类生物合成、植物激素信号转导、光合作用、植物病原体相互作用相关，与醇型相比，酮型广藿香对非生物胁迫抗性较强，对病原菌等环境胁迫较为敏感，开花机率较低，倍半萜类和脂类合成代谢较弱；酮型广藿香具有特异的“H”型甲基化位点，非甲基化位点相对较低；甲基化位点主要分布在基因间区、内含子、上游和下游区域，其中基因间区的甲基化位点数目远远高于其他基因元件，内含子、下游区域和上游区域的甲基化位点数目差异不大；CG甲基化位点数目显著多于CWG，其中基因转录起始位置（TSS）和转录终止位置（TTS）区域的CG和CWG甲基化位点数目显著低于其他区域，而基因区的CG甲基化位点数目显著高于其他区域，CWG甲基化位点主要分布在上游和基因区；5-氮杂胞苷阻断甲基化过程后，广藿香酮含量显著上升，百秋李醇/广藿香酮减小，数值小于1，解除抑制后，百秋李醇/广藿香酮增加，数值大于1，但是二者之和变化无显著性差异说明广藿香中百秋李醇与广藿香酮的合成存在此消彼长的关系，推测百秋李醇和广藿香酮具有共同底物。.综上，种质因素为广藿香化学型差异形成的主导因素，DNA甲基化水平是重要因素之一。本项目为道地药材研究提供新思路和新方法。